[发明专利]一种利用黑曲霉生产β－甘露聚糖酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种以麸皮、玉米粉和菜籽饼粉等农副产品为主原料，利用黑曲霉WA9024菌株固态发酵生产β-甘露聚糖酶的方法，属酶工程技术领域。

技术背景

β-1，4-D-甘露聚糖甘露糖水解酶(β-1，4-D-mannan mannohydrolase，EC3.2.1.78)是一类从甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖等的主链内部随机切割β-1，4-D-甘露糖苷键的水解酶，简称β-甘露聚糖酶(β-mannanase)，属于半纤维素酶类，广泛存在于低等动物、豆类植物、海洋生物及微生物中。

随着人类对自然界半纤维素酶的开发利用，以及对β-甘露聚糖抗营养因子的深入了解和甘露低聚糖生理功能的不断发现，为β-甘露聚糖酶的研究和开发提供了广阔的发展空间。目前，关于β-甘露聚糖酶的研究和生产主要来源于微生物。微生物来源的β-甘露聚糖酶具有活性高、成本低、来源稳定、提取方便以及比动植物更广的作用pH、温度范围和底物专一性等显著特点。因此，被广泛的应用于食品、医药、饲料、造纸、石油开采和生物科学研究等领域。

近年来，关于β-甘露聚糖酶的研究和开发进入了一个新的高潮。在食品工业中，由于甘露低聚糖保健价值的不断发现，使β-甘露聚糖酶在食品加工中有了更为广泛的应用。例如，在速溶咖啡生产中添加β-甘露聚糖酶，不仅能提高速溶咖啡的品质还能增加其保健价值；在果蔬汁的生产过程中加入β-甘露聚糖酶能降低原料浆汁的粘稠度，不仅大大降低了生产能耗还提高了果蔬汁的营养保健功能。饲料工业中，随着β-甘露聚糖酶许多功能(如：促进动物生长，提高动物饲料转化率；促进营养成分消化，改善动物肠道微生物生态；降低肠道内溶物的粘稠度，减少粪便排放，减轻环境污染；提高微量元素的生物利用，等)的发现，它以一种饲料添加剂的形式广泛的应用于各种动物饲料的生产。随着β-甘露聚糖酶的功能在各个行业中的不断发现，其需求量将会不断增加，为其进一步的研究生产提供了广阔的发展和市场前景。

目前，在国内外文献报道中，关于微生物β-甘露聚糖酶的研究主要包括：产β-甘露聚糖酶微生物(包括真菌、细菌、放线菌等)的筛选和诱变育种，产酶发酵工艺条件(包括固态或液体发酵培养基和培养条件等)的优化，酶的分离纯化和性质(包括酶的组分数、分子量、等电点、最适作用温度和pH稳定性、酶动力学特性和底物专一性等)的测定，以及酶基因的克隆和表达等。进入20世纪90年代以来，随着基因工程技术和蛋白质工程技术的广泛应用，越来越多的工作集中与β-甘露聚糖酶基因的克隆、表达和活性位点的研究等方面，但目前成熟的报道并不多，有关β-甘露聚糖酶固态发酵产业化生产方法则尚未见报道。

李剑芳等利用紫外和亚硝基胍诱变育种，获得了一株黑曲霉突变株L-76-1，其液体发酵产酸性β-甘露聚糖酶活性为320U/mL；柴萍萍等优化了芽孢杆菌WY45的液体发酵条件，β-甘露聚糖酶活性达2800U/mL；李江华等利用紫外诱变育种，获得了一株黑曲霉突变株WA9024，其固态发酵产β-甘露聚糖酶活性达8940U/g。Heck等对Bacillus circulans BL53菌株的固态发酵培养基进行了优化，其最高产β-甘露聚糖酶活性为560U/g；Juhasz等报道了不同碳源对Trichodermareesei产纤维素和半纤维素酶的影响，其最高产β-甘露聚糖酶活性为4500U/g。虽然国内外已有许多利用微生物液体或固态发酵生产β-甘露聚糖酶的文献报道，但发酵酶活性普遍较低，限制了该酶的广泛应用，尤其是在饲料工业和甘露低聚糖生产等领域中的应用。

现在，市场上也有作为商品用的β-甘露聚糖酶，主要有美国ChemGen公司生产的和美酵素和国内的华芬酶等。但由于价格昂贵，阻碍了β-甘露聚糖酶的大范围应用。本发明获得了一种简单、易操作、成本低、收益大的产业化生产β-甘露聚糖酶的固态发酵方法，其β-甘露聚糖酶发酵酶活性高于目前国内水平，适用于低能耗、低成本的现代酶制剂生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种以麸皮、玉米粉和菜籽饼粉等农副产品为发酵基料，利用黑曲霉WA9024菌株固态发酵生产β-甘露聚糖酶的方法。

本发明的技术方案：

固态发酵实验室小试生产β-甘露聚糖酶：

菌株：黑曲霉(Aspergillus niger)WA9024，由江南大学医学院分子生物学研究室筛选和保藏。该菌种巳在《无锡轻工大学学报》第23卷第5期，2004年9月公开。