[发明专利]鸡痘病毒表达载体p12－18及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种有利于提高重组鸡痘病毒抵抗母源抗体干扰能力的鸡痘病毒表达载体，尤其是载体中的复制非必需区，从而提供一种能够提高重组FPV疫苗抵抗母源抗体干扰能力的方法。

背景技术

鸡痘病毒(Fowlpox Virus，FPV)是继痘苗病毒VV之后的一种具有独特优越性和广阔应用前景的表达载体，是当今分子生物学领域的研究热点之一。禽痘病毒属痘病毒科，禽痘病毒属，鸡痘病毒是其代表种。FPV做为表达载体有其独特的优越性。其基因组庞大，长度约为VV的1.5倍，含较多的复制非必需区，可构建FPV多价和多联疫苗；FPV具有自身的酶系统和调控信号，其转录、翻译和装配均发生在胞浆中，可对外源基因的表达产物进行翻译后加工、修饰，保留其相应的生物学活性，诱导机体产生体液免疫和细胞免疫；与VV相比，FPV的宿主范围较窄，仅感染禽类，不易散毒，对哺乳动物和人类无潜在的威胁；重组病毒的构建方法相对简单；表达水平较高；便于对重组鸡痘病毒免疫鸡群和自然感染鸡群进行鉴别。

近十几年来，FPV载体疫苗的研究已取得了巨大进展，有多种病原体的保护性抗原基因在FPV中得以成功表达，如：MDV的gB/pp38基因、NDV的F和HN基因、IBDV的VP2/VP2-3-4基因、AIV的HA/NA/NP基因、IBV的S1基因、ALV的env基因、REV的env基因等，并在SPF鸡上有很高甚至100％的保护率。但迄今为止，重组FPV活载体疫苗在国内外尚未获得广泛应用。究其原因，主要是重组FPV疫苗的免疫效力在很大程度上受到商品鸡所携带的母源抗体的干扰，这无疑给疫苗，尤其弱毒苗和活载体疫苗的早期应用和疫情监测带来很大的困难。许多研究已经证明，针对外源蛋白的母源抗体会干扰重组FPV的免疫效力，而且母源抗体越高干扰越大。

鸡痘病毒(Fowlpox Virus，FPV)基因组庞大，长约300kb，包括约260个ORF，存在大量的复制非必需区可以做为外源基因的插入位点。构建重组FPV表达载体的第一步是要选择病毒的复制非必需区(Nonessential Region，NER)。然而，现已证实，某些复制非必需区并不是严格的复制非必需区，因为某些基因虽然是病毒在体外复制非必需的，但它们可能与病毒毒力、病毒免疫逃避或宿主范围相关，若被缺失或因插入外源基因而失活，可能导致病毒在体内的复制能力或免疫逃避能力下降，使重组FPV无法在宿主体内发挥持久而有效的免疫效力。经试验，复制非必需区FPV7S为外源基因插入位点构建了表达多种不同病原保护性抗原基因的重组FPV，在SPF鸡上均能提供100％的保护，但在有母源抗体的商品鸡上免疫效果欠佳，保护率低于50％。将FPV7S两个侧翼区的序列与Afsono等发表的美国致病株基因组的相应序列(AF198100)进行比较，发现该DNA片段共跨越FPV基因组的6个连续的编码框(ORF072-ORF077)，目的基因的插入位点位于ORF073内部。ORF073主要编码IL-18结合蛋白的类似物，IL-18bp能够抑制IL-18依赖性的IFN-γ的产生，是一种免疫调节因子。它既不是病毒的结构蛋白，也不是病毒复制、转录和翻译所必需的酶类，揭示了FPV7S适合作为转移载体复制非必需区的分子基础。但ORF073的破坏可能是影响以FPV7S为外源基因插入位点的重组FPV在有母源抗体商品鸡上免疫效力的主要原因。因此，有必要筛选适当的复制非必需区作为外源基因的插入位点，这可能是克服重组FPV母源抗体干扰的一个有效策略。克服母源抗体干扰是重组FPV疫苗研究领域亟待解决的一个难题。

发明内容

本发明目的在于设计一种有利于克服母源抗体干扰的鸡痘病毒表达载体p12-18。

本发明鸡痘病毒表达载体p12-18于2005年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO：1385，其长度为10450bp，该载体以鸡痘病毒复制非必需区FPV12-18为外源基因插入位点，是一个含有鸡痘病毒复制非必需区侧翼区FPV1和FPV2的表达载体，FPV1的核苷酸长度为1863bp，FPV2的核苷酸长度为1554bp，FPV1和FPV2的DNA序列分别为：

FPV1：

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