[发明专利]表达新城疫病毒HN基因的重组鸡痘病毒活载体疫苗rFPV-1218NDHN及其构建方法

权利要求书

1、表达新城疫病毒HN基因的重组鸡痘病毒活载体疫苗rFPV-1218NDHN，其特征在于：其保藏号为CGMCC NO：1912。

2、如权利要求1所述表达新城疫病毒HN基因的重组鸡痘病毒活载体疫苗rFPV-1218NDHN的构建方法，其特征在于：利用FPV表达载体p12-18，将新城疫病毒HN基因通过同源重组插入到282E4株鸡痘病毒的复制非必需区FPV12-18，从而获得了表达新城疫病毒HN基因的重组鸡痘病毒活载体疫苗rFPV-1218NDHN。

3、根据权利要求2所述表达新城疫病毒HN基因的重组鸡痘病毒活载体疫苗rFPV-1218NDHN的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)表达新城疫病毒HN基因的转移载体的构建：

将ZJ1株新城疫病毒NDV的HN基因插入表达载体p12-18，获得表达NDV HN基因的重组FPV转移载体p1218NDHN，用碱裂解法制备转移载体的质粒DNA并以PEG纯化质粒DNA；

(2)表达新城疫病毒HN基因的重组鸡痘病毒的构建：

将(1)中构建的转移载体p1218NDHN与282E4株FPV共转染CEF。

4、根据权利要求2所述表达新城疫病毒HN基因的重组鸡痘病毒活载体疫苗rFPV-1218NDHN的构建方法，其特征在于步骤(2)中，在35mm培养皿中培养CEF，使形成60％的单层后以0.1MOI的282E4株FPV感染，37℃吸附2小时后倾去上清培养基，加1ml含10％小牛血清的DMEM培养基；将1μg转移载体溶解于50μl的无血清DMEM培养基；取5μl转染试剂FuGENE^TM6缓慢加入到100μl无血清DMEM培养基中，两者混匀置室温作用15min，然后缓缓滴加至上述CEF中，边滴边混匀，置37℃培养3小时后补加1ml含10％小牛血清的DMEM培养基；12h后更换为含1％小牛血清的DMEM培养基，置37℃继续培养；CEF产生80％病变后收获病毒，反复冻融3次，低速离心去除细胞碎片，上清用于重组病毒的筛选和纯化，将上清稀释液接种60mm平皿上长成致密单层的CEF，37℃培养约72h，待出现较多病毒蚀斑后，用含有200μg/ml X-gal的营养琼脂覆盖，待出现蓝色蚀斑后挑取蓝色蚀斑，用吸管将其吸出，转入0.5ml细胞培养维持液中，冻融3次，低速离心去除细胞与琼脂碎片，取上清感染次代细胞，在60mm平皿中重复进行以上步骤后，于96孔板上筛选数次，直至在X-gal存在的条件下，重组病毒在CEF上所形成的蚀斑全部呈蓝色，即可得到纯化的重组病毒，即表达新城疫HN基因的重组鸡痘病毒活载体疫苗rFPV-1218NDHN。