[发明专利]心肌肌钙蛋白I纳米金标检测试纸条及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种人体血液中的心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)的检测试纸条及其制备方法，属于生物技术应用领域。

背景技术

cTnI是心肌收缩的调节蛋白，存在于心肌肌原纤维上，少量cTnI以游离形式存在于心肌细胞胞浆内。心肌受损早期，心肌细胞膜完整性被破坏，游离形式的cTnI进入血液。cTnI在血液中出现的时间窗可从心肌受损后4～6小时直到2周，由于cTnI具有高度的心肌特异性，对于心肌损伤的高度敏感性及较长的诊断窗口期，cTnI已成为一种重要的心肌组织损伤特异性标识物。从上世纪九十年代起，cTnI已逐渐开始替代CK-MB，成为诊断心肌损伤的首选生化指标之一。1999年和2000年世界生化检测标准化协会、欧洲心脏病协会和美国心脏病学会提出了新的AMI定义和诊断标准，血清标志物检测，特别突出肌钙蛋白检测的重要性。2001年美国心脏病学会和心脏病协会提出测定cTnI作为诊断急性心肌梗死和急性冠状动脉综合征危险分层的第一位标准。由于应用和检测生化标志物，推动急性诊断定义的变化。2000、2001、2002、2003年美国、欧洲心脏病学会、英国、意大利以及中国分别拟定指南或发布科学家共识文件，指出诊断急性冠状动脉综合征首要依据就是检测生化标志物，cTnI为首选。目前，cTnI检测已广泛应用于急性心肌梗死、不稳定型心绞痛、急性心衰、心肌炎、心脏手术损伤评估、窒息新生儿心肌损伤等心肌损伤疾病的诊断、危险度分层和预后评判。美国每年因怀疑性冠状动脉综合征急诊就医病人达8000万，其中45％左右与心脏相关，15％诊断为急性冠脉综合征。我国急性冠状动脉综合征的发病率约50/10万，每年死于急性心肌梗死的人数超过100万。因此，cTnI检测的应用具有重要的社会和经济效益。

传统的金标试纸条技术，捕捉单抗均使用1株抗体。由于人体血液中cTnI可被蛋白酶降解，血中cTnI即有完整多肽存在(包括与肌钙蛋白复合体)，又有降解片段存在，单一的捕捉单抗不能完全反映血中cTnI水平，使得金标试纸条检测灵敏度较低，通常在10ng/ml以上。

发明内容

本发明要解决的技术问题就是传统的金标试纸条检测灵敏度较低的问题，提供一种人血心肌肌钙蛋白I纳米金标检测试纸条及其制备方法。

为解决上述技术问题，本发明所述心肌肌钙蛋白I纳米金标检测试纸条采用如下技术方案：

①采用3株可互相形成夹心配对的抗人cTnI单克隆抗体，其中2株作为捕捉抗体，1株作为显色抗体；②用15～25nm纳米金颗粒标记显色抗体。

前述试纸条的制备方法包括如下步骤：

1.纳米金颗粒溶液的制备：应用柠檬酸三钠还原法制备纳米金颗粒溶液；

2.显色抗体的金标记：调节纳米金颗粒溶液pH值至8.0～8.5，显色抗体与纳米金颗粒溶液反应结合，离心后重悬；

3.金标垫制备及喷垫：玻璃纤维膜预处理后，烘干，用金标抗体喷印；

4.检测线制备：将2株捕捉抗体按蛋白量等比例混合后在已活化的硝酸纤维膜上喷划检测线，真空干燥；

5.质控线制备：用羊抗鼠IgG在已活化硝酸纤维膜上喷划质控线，真空干燥；

6.试纸条装配：按样品垫、金标垫、硝酸纤维膜、吸水纸顺序粘贴在单面压敏胶的塑料板上，切割，装入塑料卡，包装。

本发明制备工艺简单，操作简便、灵敏度可达到1.0ng/ml、结果稳定。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明：1.20nm纳米金颗粒的制备

(1)玻璃器皿用洗液(7％重铬酸钾，50％浓硫酸)浸泡6小时，分别用自来水、蒸馏水和去离子水清洗3～4次。

(2)称取1g氯化金(HAuCl₄·4H₂O)溶解于100ml去离子水，称取1g柠檬酸三钠溶解于100ml去离子水。

(3)1.5ml 1％氯金酸加入到150ml去离子水中，加热至沸腾。沸腾1分钟后，用叶尾玻棒搅拌，高速搅动下准确迅速加入2.7ml 1％柠檬酸三钠，待氯金酸水溶液变为紫红色后，继续搅拌煮沸10分钟，冰水冷却5分钟。

(4)反应液以7800g离心40分钟，沉淀用120ml去离子水重悬，400nm～650nm扫描，间隔10nm，每批次制备的纳米金颗粒溶液以最大吸收峰519～520nm为标准，得到20nm的纳米金颗粒溶液，避光保存。

2.显色抗体的金标记