[发明专利]乌桕组培不定芽高频率植株再生的方法

说明书

技术领域

本发明涉及乌桕组织培养获得高频率不定芽植株再生的技术方法，属于生物技术领域，专用于中国原产乌桕试管苗微繁殖和体细胞突变体筛选，并适用于农杆菌介导法基因转化。

技术背景

乌桕(Sapium Sebiserum)为大戟科乌桕属的落叶乔木，它是我国七大秋季观赏红叶景区中林相的主要组成树种。乌桕的叶子是染丝织品的一种黑色染料。叶的浸出液是一种土农药，用来杀灭棉蚜等害虫，还可防治稻热病，乌桕也是我国特有的油用经济树种，它种子表面附有一层白色蜡质，叫做“皮油”，可以用作蜡烛、肥皂的原料，制造蜡纸、护肤脂、固体酒精、高级香料和金属防锈涂料等；而用种子榨的油叫梓油，它的物理化学性质可跟桐油媲美。榨油后的乌桕子饼可作饲料，也是一种优质有机肥料。最近的研究发现它对二氧化硫、氟化氢和氯气抗性均强，也是很好的净化环境的树种，研究表明乌桕还是一种理想的生物质能源作物，可见，乌桕是一种具有多种经济用途和巨大价值的观赏能源兼优的高效经济植物，国内外种植面积有迅速扩大的趋势。但由于乌桕是两种基因型间的异花授粉植物，在长期反复异花授粉过程中，使得当今自然分布和栽培的品种都是杂种，有性繁殖不能充分固定和利用杂种优势，再加上它的果皮坚硬，它生理和环境的强迫休眠特性，繁育周期长，自然结果需要4～5年以上。自然开花或人工诱导其开花，均由于种子成熟期不一、易于落粒和发芽率极低，在生产上只能采用种茎无性繁殖的方法提供种苗，成活率只有30％，而且长期的扦插繁殖容易造成真菌与病毒的累积，导致品种退化，严重地影响了其大面积推广和其他经济用途的研究。

有关乌桕微繁的研究最早见于印度科学家乌桕芽微繁的报告(1997)，主要通过腋芽再生，经10个月繁殖成苗，但其中没有涉及繁殖系数和成活率的报道；国内韩珊等(2006a)报道，以红叶乌桕新抽出的幼嫩叶片为材料，进行组织培养，已成功培育出试管苗并移栽至大田，移栽成活率为76％。韩珊等(2006b)报道，以带芽茎段、茎尖做外植体，通过腋芽生枝，再生出植株。结果表明：①外植体用升汞分两次共处理8min，污染率低；②启动培养以MS+6-BA 1.0mg/L+2，4-D 0.05mg/L+NAA 0.1mg/L为最佳配方；③接种后先进行暗培养1周，启动较快；④继代培养以MS+6-BA1.0mg/L+IBA 0.1mg/L；⑤生根诱导以1/2MS+NAA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L效果最好，其生根率为87.6％；⑥生根苗移栽到珍珠岩∶蛭石∶河沙＝3∶2∶1的育苗基质中，成活率为83.2％，且不论它在我国的适应性，上述方法均是用带芽的组织为外植体，其生根和移栽成活率都不高，繁殖系数没有增加，而且通过芽诱导的植株也会随扩繁代数的增加其分化再生能力逐渐减弱，而涉及我国原产乌桕离体培养的报道极少，也未见相关的专利技术。迄今为止尚未见国内外通过不定芽诱导的高频率乌桕组织培养植株再生技术的报道。

发明内容

本发明的目的在于：针对乌桕自然繁殖周期长，长期反复异花授粉过程中，容易影响品种品质，且自然开花或人工诱导其开花，均由于种子成熟期不一、易于落粒和发芽率极低，而采用种茎无性繁殖的方法成活率低，长期的扦插繁殖容易造成真菌与病毒的累积，导致品种退化的问题，以及已有的通过腋芽生枝的乌桕微繁技术尚存在的优良品种变异、繁殖系数低以及成活率不高等问题，需要提供一种通过不同的外植体，扩大繁殖母体以及大幅度提高繁殖系数的乌桕组培不定芽高频率植株再生的方法。

本发明的目的是这样实现的：一种乌桕组培不定芽高频率植株再生的方法，其特征在于：取乌桕种子去除种皮，表面消毒后接种到种子发芽培养基中，每50ml的三角瓶中放入1粒种子，置于培养室培养，经过16～20d，长出完整的乌桕植株；在无菌条件下，沿乌桕种子苗的纵向一分为二分割获得子叶块、含未展开真叶的顶芽以及横向分割获得下胚轴切段和根切段，将它们分别接种于子叶、顶芽、下胚轴以及根不定芽诱导培养基，置于培养室培养，20d后获得嫩绿色不定芽丛；将嫩绿色不定芽丛移入不定芽伸长培养基，置于培养室生长20～25d后，长出2～3cm高的具展开3～5片真叶的健壮幼苗；再转入幼苗扩繁培养基置于培养室进行扩大繁殖，14～21d后将经扩繁的幼苗转接于生根培养基置于培养室，12～15d长成根系发达的健壮试管植株，最后移栽到菜园土经湿热高压灭菌的营养钵中在室外自然光照条件下炼苗，得到乌桕的健壮苗；

培养室的温度为26℃～28℃，每天由散射光照14～16h。