[发明专利]鉴别黄独性别的引物、片段与方法

说明书

技术领域：

本发明属于分子标记技术领域，是一组鉴别黄独性别的引物、片段与方法。

背景技术：

黄独Dioscorea bulbifera L.为薯蓣科Dioscoreaceae薯蓣属Dioscorea L.植物，世界广布种，散布于非洲、美洲和亚洲等地。黄独花单性，雌雄异株，且性别表现稳定。黄独块茎和零余子(珠芽)富含淀粉和糖，在非洲、东南亚和玻利尼西亚等地广泛栽培和食用。在我国黄独块茎为常用中药，又名黄药子，其性凉，味苦，有散结消瘦、清热解毒、凉血止血、抗癌的功效。与黄独同属的盾叶薯蓣Dioscorea zingiberensis C.H.Wright，其根茎中含有薯蓣皂苷元，是甾体激素类药物的重要药源植物，且有研究表明，其雄株根茎中的薯蓣皂苷元含量高于雌株，因此生长上早期筛选到盾叶薯蓣雄性植株具有重要的经济价值。但是在栽培条件下，盾叶薯蓣的性别表现比较复杂，没有同属的黄独稳定，因此从分子水平找到一种DNA标记来鉴别发育早期的黄独植株具有重要的应用价值，对盾叶薯蓣植株早期雌雄鉴别具有重要的实践意义。

自从1990年Williams和Welsh创立RAPD(Random Amplified polymorphie DNA)技术以来，该技术已成功用于植物的性别差异研究。SCAR(sequence characterized amplified region)分子标记，是根据RAPD分子标记的序列分析结果用20-28个碱基的特异引物进行PCR扩增得到的，对基因组限定区域可重复高特异性的扩增。目前RAPD-SCAR标记技术已在很多植物的性别研究中获得成功，如大麻(Cannabis sativa L.)与Y染色体连锁的RAPD-SCAR雄性标记、番木瓜(Carica papaya L.)RAPD-SCAR雄性标记物。

目前国内外尚无有关分子标记鉴别黄独性别方法的报道，本发明填补了该领域的空白。

发明内容：

本发明目的是提供鉴别黄独性别的一组引物和一段DNA片段；

本发明的另外一个目的是提供一种鉴别黄独性别的方法。

本发明运用RAPD方法在雄性黄独基因组中扩增出一条雄性特异性条带，通过克隆和测序获得了一段长度为681bp的DNA序列(SEQ ID NO：1)，并根据此序列设计了一组鉴别黄独性别的引物，其序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示，根据该对引物在黄独基因组中能够扩增得到一条雄性特异性序列，其长度为677bp。

本发明提供一种鉴别黄独性别的方法，其特征在于方法是根据样品的PCR反应产物琼脂糖凝胶电泳结果鉴定样品的性别。该方法中特异性引物为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。该方法中PCR产物电泳结果出现长度为677bp的条带，该样品为雄株，面相同部位没有出现条带的样品为雌株。

PCR反应体系为20μl，反应液组成为10×PCRbuffer，2.5mmol/L的dNTPs，25mmol/L的MgCl₂，1u的Taq DNA聚合酶，0.4μmol/L随机引物，20-50ng模板DNA。在PE-9600PCR仪上按下面的循环程序进行PCR扩增：94℃预变性3min；94℃变性45s，38℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存。

本发明一共实验了100个RAPD随机引物，购自上海英骏生物有限公司，在雄性黄独基因组中扩增出一条681bp雄性特异性条带(其DNA序列为SEQ ID NO：1)，含有多个终止子，属非编码序列，将该序列在Genebank上进行序列比对，未发现与之同源的序列。根据该特异性条带测序结果，设计出一对特异性引物SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。

根据全序列设计出一对SCAR特异引物：

SEQ ID NO：25′-GGCTTCTGTCACTACATGGG-3′

SEQ ID NO：35′-GGCTTCTGTCCAGTGCATCT-3′

通过已知性别的35个黄独个体检验这对引物的有效性，SCAR反应表明在所有13个黄独雄株个体的DNA电泳结果中均出现了677bp条带，而22个黄独雌性个体中相应部位没有出现该条带(图1，2)。

综上所述，本发明提供了一段长度为681bp的黄独雌雄特异性的DNA序列，可以用于黄独的雌雄性别鉴定。检验结果证明了本发明中引物和PCR方法可以准确鉴别出黄独雌雄的性别。

附图说明：