[发明专利]一种诱导植物内生真菌产生活性的发酵液配方及条件

说明书

技术领域：

在药学领域中本发明提供了一种可诱导伊犁贝母内生真菌发酵产生活性物质的培养基配方及发酵条件。

背景技术：

植物内生真菌(endophytic fungi)在广义上是指生活在植物体内或在其生活史的一定阶段处于植物体内，形成不明显侵染的一类真菌。自Stierle等从太平洋红豆杉中获得能够产生紫杉醇的内生真菌后，利用药用植物内生真菌发酵以获得活性物质或其它物质成为植物生物技术的一个热点领域。在获得药用植物内生真菌后，由于内生真菌需要在特殊条件下才能产生活性物质，因此，获得一个具有诱导植物内生真菌产生生物活性的培养基配方及培养条件具有重要意义。

为了解伊犁贝母的内生真菌资源和特点，我们分离并获得了伊犁贝母鳞茎中的多种内生真菌，通过对不同培养基配方的改进与对培养条件的优化，获得了能使其中一株真菌产生抗菌及抑制结肠癌细胞生长的培养基配方及条件。该培养方法在其它一些培养条件无法诱导内生真菌产生活性的情况下，能够诱导伊犁贝母的内生真菌产生出生物活性，有望为其它一些内生真菌的培养提供条件。

发明内容：

本发明的目的在于筛选出能够诱导植物内生真菌产生活性物质的培养基配方及培养条件，为内生真菌的培养提供方法。

本发明获得了诱导药用植物内生真菌产生抗菌和抗结肠癌肿瘤细胞活性的培养基配方及培养条件。

本发明的具体技术方案如下：

利用PDA培养基获得分离自新鲜、健康伊犁贝母鳞茎中的内生真菌。

优选的发酵条件为：(1)发酵液成分：1000ml培养基含蔗糖36g；NaNO₃ 2g；KCl 0.5g；MgSO₄.7H₂O 0.5g；FeSO₄ 0.01g；K₂HPO₄ 1g；酵母膏1g；蛋白胨10g；赤霉素0.3mg；pH7.0-7.2。(2)发酵条件：28℃，150r/min的振摇下培养7天。

利用打孔法和MTT法筛选并优化出最佳培养基配方及培养条件。

本发明的进步性如下：本发明获得一种能够诱导植物内生真菌产生抑制多种病源菌及抑制结肠癌肿瘤细胞生长的活性的配方及培养条件。本发明有望能够诱导其它一些微生物产生活性。

具体实施方式

材料

(1)无菌滤纸、剪刀、镊子、解剖刀、研钵、电炉、微波炉、电子天平、超净工作台、恒温培养箱、高压灭菌锅、冷冻柜、恒温水浴锅、离心机、显微镜等。

(2)无菌水；100％乙醇；升汞；内生真菌分离用PDA马铃薯培养基；MTT法使用的RPMI1640培养基为美国Gibco公司产品；抑菌活性筛选用肉汤培养基；发酵用液体培养基：(1000ml培养基含蔗糖36g；NaNO₃ 2g；KCl 0.5g；MgSO₄.7H₂O 0.5g；FeSO₄ 0.01g；K₂HPO₄1g；酵母膏1g；蛋白胨10g；分装，121℃灭菌20min备用，用前加入用无菌方法配置为溶液的赤霉素0.3mg)；PD马铃薯液体培养基；麦芽汁培养基；改良MM培养基。

(3)伊犁贝母：伊犁贝母新鲜、健康的鳞茎样品于2006年3月收集自新疆莫呼尔，

(5)病源菌：绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、大肠杆菌(Escherichia coli)、克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、白色念珠球菌(Candida albicans)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)；LoVo结肠癌细胞均为中国药科大学保存。

方法

内生真菌的PDA分离方法和划线纯化方法、打孔法测定抑菌活性及MTT测定肿瘤抑制活性均属于常见方法，具体过程在许多高校图书馆藏相关图书中均可获得。PDA、PA、麦芽汁培养基、改良MM培养基等配方及制法参见：范秀容，李广武，沈萍编.微生物学实验(第二版).北京：高等教育出版社，1994。通过对比不同培养基配方及发酵条件下发酵液产生的抑菌、抑肿瘤活性筛选能诱导内生真菌产生生物活性的培养基配方及条件。

实施例1诱导植物内生真菌的发酵液配方筛选