[发明专利]重组禽腺联病毒载体介导的鸡输卵管生物反应器制备方法

权利要求书

1、重组禽腺联病毒载体介导的鸡输卵管生物反应器制备方法，包括以下步骤：

a、鸡输卵管特异表达载体pOV3K的改造：切除鸡输卵管特异表达人组织激肽释放酶基因的载体pOV3K中的鸡卵清蛋白ov基因的1568-2860位核苷酸区域，将其余片段回收，经Klenow酶补平后连接，获得由1.7kb ov5′调控区和牛生长激素基因polyA控制人组织激肽释放酶基因表达的鸡输卵管特异表达载体pOV5K；

b、含鸡输卵管特异表达控制元件和人组织激肽释放酶基因的禽腺联病毒转移载体的构建：先用限制酶Pml I将含禽腺联病毒全基因组的质粒pCR-AAAV线性化，电泳分离后回收，再用限制酶BsmB I消化，电泳分离后回收含禽腺联病毒末端反向重复序列ITR的4.1Kb片段，用Klenow酶补平，获得禽腺联病毒转移载体pAITR；根据pOV5K中ov5′调控区和牛生长激素基因PolyA序列设计一对引物：

Forward：5-CTTGGCGCGCGCAGACTGACATGCATTTCATAGG-3

Reverse：5-TCGGGGTACCAGCGGAAGAGCGCCCAATACG-3

以pOV5K为模板，用聚合酶链式反应PCR扩增人组织激肽释放酶基因表达盒，与转移载体pAITR连接，获得含鸡输卵管特异表达控制元件和人组织激肽释放酶的禽腺联病毒转移载体pAITR-OV5K；

c、重组禽腺联病毒的制备：根据禽腺联病毒Rep基因5′端和Cap基因3′端序列设计引物，以pCR-AAAV为模板，用PCR扩增Rep-Cap编码区，插入pcDNA3.1/Zeo+载体后获得禽腺联病毒辅助质粒pcDNA-ARC；将转移载体pAITR-OV5K、辅助质粒pcDNA-ARC、腺病毒辅助质粒pHelper组成三质粒系统，转染AAV-293细胞，获得鸡输卵管特异表达人组织激肽释放酶基因的重组病毒；

d、产蛋鸡的重组病毒注射：用PBS缓冲液溶解纯化和浓缩的重组病毒，并稀释成2×10¹⁰病毒颗粒/毫升，翅静脉注射产蛋鸡，用免疫转印和酶活性检测法测定蛋清中目的蛋白的表达水平和组织特异性。

2、根据权利要求1所述重组禽腺联病毒载体介导的鸡输卵管生物反应器制备方法，其特征在于：步骤c中，利用禽腺联病毒转移质粒pAITR-OV5K及辅助质粒pcDNA-ARC与腺病毒辅助质粒pHelper共转染AAV-293细胞，产生的纯化重组病毒感染性滴度大于2×10¹⁰病毒颗粒/毫升。

3、根据权利要求1所述重组禽腺联病毒载体介导的鸡输卵管生物反应器制备方法，其特征在于：在步骤d中，利用重组病毒注射产蛋鸡，外源基因仅在鸡输卵管表达，蛋清中的重组酶表达时间维持6周以上。