[发明专利]柠檬酸测定试剂盒及柠檬酸浓度测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种柠檬酸测定试剂盒，同时本发明还涉及测定柠檬酸浓度的方法，属于食品/环境检验测定技术领域。

背景技术

柠檬酸主要用于食品、饮料行业作为酸味剂、调味剂及防腐剂、保鲜剂，也用于制备医药清凉剂，还在化工行业、化妆品行业及洗涤行业中用作抗氧化剂、增塑剂、洗涤剂。

强制性国家标准GB17203-1998《食品添加剂柠檬酸钙》规定，柠檬酸钙含量为98.0～100.5％。国家质检总局组织对食品添加剂剂柠檬酸其盐类(柠檬酸、柠檬酸钾、柠檬酸钠、柠檬酸钙)产品质量进行了国家监督抽查。抽查中发现的主要质量问题是柠檬酸钙含量不合格。抽查中有个别产品食品添加剂剂柠檬酸钙含量超过国家标准规定的要求。主要是原料碳酸钙转化不完全，成品中存在杂质。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定柠檬酸浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的柠檬酸测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行柠檬酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明柠檬酸浓度测定方法原理如下：

柠檬酸+辅酶A柠檬酸合成酶乙酰辅酶A+草酰乙酸+水乙酰辅酶A+二氧化碳+还原型辅酶丙酮酸脱氢酶丙酮酸+辅酶A+辅酶

这种方法应用柠檬酸合成酶(citrate synthase；EC 2.3.3.1EC 2.3.3.3)酶(偶)联丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase；EC 1.2.1.51)酶促反应连续监测法/速率比色法。柠檬酸合成酶酶解柠檬酸反应产生乙酰辅酶A，再通过(偶)联合丙酮酸脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的程度/速度，通过测量340nm处吸光度下降的程度/速度，可以测算柠檬酸的浓度大小。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明柠檬酸测定试剂盒较为理想：

缓冲液                                          100mmol/L

稳定剂                                          500mmol/L

还原型辅酶                                      0.25mmol/L

辅酶A                                           5mmol/L

二氧化碳                                        20mmol/L

柠檬酸合成酶                                    10000U/L

丙酮酸脱氢酶                         12000U/L

本发明的柠檬酸测定试剂盒可以是单剂，包括：

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、辅酶A、二氧化碳、柠檬酸合成酶、

丙酮酸脱氢酶。

试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、辅酶A、二氧化碳。

试剂2

缓冲液、稳定剂、柠檬酸合成酶、丙酮酸脱氢酶。

还原型辅酶、辅酶A、二氧化碳、柠檬酸合成酶、丙酮酸脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、辅酶A、二氧化碳。

试剂2

缓冲液、稳定剂、丙酮酸脱氢酶。

试剂3

缓冲液、稳定剂、柠檬酸合成酶。