[发明专利]D－乳酸诊断/测定试剂盒及D－乳酸浓度测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用具有D-乳酸特异性的D-乳酸诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定D-乳酸浓度的方法，属于医学/食品检验测定技术领域。

背景技术

L-乳酸是近年来人们十分关注并发展较快的有机酸。同时L-乳酸具有在食品、饲料、医药、塑料、饲料、农药、日用化工、造纸及电子工业等多领域应用前景。

L-乳酸是大多数生物体代谢作用的终产物。仅少数微生物(例乳酸菌属、明串珠菌属)能形成D-乳酸。生产酸奶时非常注意检测乳酸盐，以评估微生物是否产生L-乳酸，D-乳酸或二者兼有。若有D-乳酸存在，则可能是微生物造成了污染。

乳酸盐浓度的异常升高与多种疾病如糖尿病、酸毒症等疾病有密切的关系。L(+)-Lactate是人体中乳酸盐代谢的主要中间产物，并且存在于血液中。D(-)-Lactate也存在，但含量很低，只有L(+)-Lactate的1-5％。

血乳酸测试作为一个监护、监测运动员训练能力的手段，把血乳酸值作为衡量运动员有氧耐力水平、无氧训练能力、身体疲劳恢复等方面的一个重要数据，供安排训练时参考。

酶法分析是国际上公认的分析方法，已被多个国际权威组织或机构采纳：如IFU(国际果汁生产者协会)，AIJN(欧盟果蔬汁及饮料生产者联盟)，及MEBAK，OICC，VDLUFA等组织广为推崇，并确定为标准检测方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用具有D-乳酸特异性的酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定D-乳酸浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的D-乳酸诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行D-乳酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明D-乳酸浓度测定方法原理如下：

D-乳酸+2高铁细胞色素cD-乳酸脱氢酶丙酮酸+

                                 2亚铁细胞色素c

丙酮酸+氨离子+还原型辅酶丙氨酸脱氢酶L-丙氨酸+

                                    水+辅酶

这种方法应用具有D-乳酸特异性的D-乳酸脱氢酶(D-Lactatedehydrogenase；EC 1.1.2.4；EC 1.1.2.5)偶联丙氨酸脱氢酶(alaninedehydrogenase；EC 1.4.1.1)酶促反应连续监测法/终点比色法。D-乳酸脱氢酶酶解D-乳酸反应产生丙酮酸，再通过(偶)联合丙氨酸脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的程度/速度，通过测量340nm处吸光度下降的程度/速度，可以测算D-乳酸的浓度大小。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明D-乳酸诊断/测定试剂盒较为理想：

缓冲液            100mmol/L

稳定剂            500mmol/L

还原型辅酶        0.25mmol/L

2高铁细胞色素c    10mmol/L

氨离子            20mmol/L

D-乳酸脱氢酶      10000U/L

丙氨酸脱氢酶      12000U/L

本发明的D-乳酸诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括：

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、2高铁细胞色素c、氨离子、D-乳酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶。

试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、2高铁细胞色素c、氨离子。

试剂2

缓冲液、稳定剂、D-乳酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶。