[发明专利]乙酸测定试剂盒及乙酸浓度测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种乙酸测定试剂盒，同时本发明还涉及测定乙酸浓度的方法，属于食品/环境检验测定技术领域。

背景技术

随着配制食醋标准的出台，食品添加剂乙酸(醋酸)的质量合格与否又直接关系着人民身体健康与否。在条文强制性标准配制食醋G B10337-2000中明确规定，配制食醋所用的乙酸应符合G B 1903-1996的规定，即应符合食品添加剂醋酸的要求。用工业醋酸假冒“食品添加剂醋酸”，例如，使用某些副产品或回收的工业醋酸进行脱色，浓度不够时加入盐酸、磷酸等以增加酸度。这类醋酸对人体的危害很大，因为这类醋酸不仅含有添加的有毒、有害无机物，还含些很难说清的有害有机物。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定乙酸浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的乙酸测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行乙酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明乙酸浓度测定方法原理如下：

乙酸+二氧化碳+亚铁细胞色素b1丙酮酸氧化酶

丙酮酸+高铁细胞色素b1+水

二氧化碳+丙酮酸+还原型辅酶苹果酸脱氢酶(脱羧化)

L-苹果酸+辅酶

这种方法应用丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase；EC 1.2.2.2)酶(偶)联苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase；EC 1.1.1.38；EC 1.1.1.39；EC 1.1.1.40；EC 1.1.1.83)酶促反应连续监测法/速率比色法。丙酮酸氧化酶酶解乙酸反应产生丙酮酸，再通过(偶)联合苹果酸脱氢酶的脱羧化作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的程度/速度，通过测量340nm处吸光度下降的程度/速度，可以测算乙酸的浓度大小。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明乙酸测定试剂盒较为理想：

缓冲液          100mmol/L

稳定剂          500mmol/L

还原型辅酶      0.25mmol/L

二氧化碳        20mmol/L

亚铁细胞色素b1  5mmol/L

丙酮酸氧化酶    8000U/L

苹果酸脱氢酶    10000U/L

本发明的乙酸测定试剂盒可以是单剂，包括：

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、二氧化碳、亚铁细胞色素b1、丙酮酸氧化酶、苹果酸脱氢酶。

试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、二氧化碳、亚铁细胞色素b1。

试剂2

缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶、苹果酸脱氢酶。

还原型辅酶、二氧化碳、亚铁细胞色素b1、丙酮酸氧化酶、苹果酸脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、二氧化碳、亚铁细胞色素b1。.

试剂2

缓冲液、稳定剂、苹果酸脱氢酶。

试剂3

缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶。

还原型辅酶、二氧化碳、亚铁细胞色素b1、丙酮酸氧化酶、苹果酸脱氢酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定乙酸浓度的方法，其还原型辅酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH中的一种。

具体实施方式

下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。

实施例一

本实施例的乙酸测定试剂为单试剂，包括：