[发明专利]一种藻毒素免疫亲和层析柱的制备与使用方法

权利要求书

1.一种藻毒素免疫亲和层析柱的制备方法，其特征是制备步骤如下：

(1)将所需量的藻毒素抗体：单抗或多抗，溶于pH8.3含有0.5M NaCl的0.1M NaHCO₃缓冲液中，每毫克藻毒素抗体冻干粉末用10-50mL缓冲液溶解；

(2)称取适量溴化氰活化的琼脂糖冻干粉末，用适量1mM的稀盐酸使其溶胀，然后在烧结玻璃滤器上冲洗以除去杂质，1g琼脂糖干粉溶胀为3.5mL凝胶，1mL琼脂糖凝胶结合0.5-10mg抗体；

(3)将溶胀后的琼脂糖凝胶在pH8.3含有0.5M NaCl的0.1M NaHCO₃缓冲液中与(1)制备得到的抗体溶液均匀混合，并在室温下震荡充分反应1-3小时，或在4℃下过夜；

(4)用pH8.3含有0.5M NaCl的0.1M NaHCO₃缓冲液洗去未与琼脂糖凝胶结合的游离抗体，得到琼脂糖-抗体偶联复合物；

(5)将琼脂糖-抗体偶联复合物转入pH8.0的含0.5M NaCl的0.1MTris-HCl缓冲液，或pH8.0的含0.5M NaCl的1M乙醇胺溶液中，保持1-3小时，以封闭琼脂糖凝胶中多余的活性基团；

(6)步骤(5)得到的琼脂糖-抗体偶联复合物用不少于5倍载体体积的pH4.0的含0.5M NaCl的0.1M醋酸缓冲液洗，和用不少于5倍载体体积的pH8.0的含0.5M NaCl的0.1M Tris-HCl洗，此洗涤过程重复三次；

(7)防腐处理：步骤(6)制备好的琼脂糖-抗体偶联复合物如需放置一段时间，应使用含有1/10000叠氮钠的PBS缓冲液浸泡，然后沥去多余的溶液后放入包装袋或瓶中在4℃中密闭保存，待用；

(8)装柱：将步骤(6)或(7)得到的琼脂糖-抗体偶联复合物填充入层析柱或固相萃取空柱管中，即制成藻毒素免疫亲和层析柱；

(9)保存：琼脂糖-抗体偶联复合物或填充好的藻毒素免疫亲和层析柱切勿冷冻，保存在4℃的冰箱内，1年之内性能稳定；

(10)柱的再生：用4-10个柱床体积pH8.5含0.5M NaCl的0.1M Tris-HCl缓冲液，和用4-10个柱床体积pH4.5含0.5M NaCl的0.1M醋酸钠缓冲液轮流清洗免疫亲和层析柱2次，再用PBS缓冲液充分平衡免疫亲和层析柱后保存在4℃冰箱内供下次使用，免疫亲和层析柱经过再生后可再次使用，每根免疫亲和层析柱可反复再生使用5-10次。

2.如权利要求1所述方法制备的藻毒素免疫亲和层析柱的应用方法，其特征是：

(A)样品中藻毒素的分离纯化：

(1)水样

制备的藻毒素免疫亲和层析柱先依次用5mL甲醇和5mL蒸馏水预处理；1L水样通过玻璃GF/C微纤维过滤器或0.45μm微孔滤膜过滤，滤液过处理好的藻毒素免疫亲和层析柱，然后依次用5mL PBS和5mL蒸馏水洗；最后用10mL纯甲醇洗脱，洗脱液减压蒸干，残留物用0.5mL 30％甲醇溶液溶解后进HPLC分析；

或(2)藻类及其制品

将粉碎藻粉按1g藻粉加10-30mL 5％乙酸的比例加入5％乙酸中，搅拌抽提30-90min，离心分离，收集上层清液，沉淀再重复抽提两次，合并上清液并过滤，滤液按(1)水样的方法处理后进HPLC分析；

或(3)水产品

水产品样品用丁醇+甲醇+水，5+25+70体积分数，抽提30-120min；肝脏试样用pH＝7的含50mM Tris-HCl、2mM EDTA、2mM 2-ME和10％甘油溶液抽提30-120min；抽提液按(1)水样的方法处理后进HPLC分析；

(B)藻毒素净化样的HPLC分析

藻毒素净化样进HPLC分析，色谱条件如下：

色谱柱为Kromasil 100-5C₁₈ 250×4.6mm，高效液相色谱仪为Waters 2965配合Waters 996二极管阵列检测器，流动相为含0.08％甲酸的去离子水∶乙腈＝60∶40(v/v)，流速为1mL/min，柱温均在30℃，进样量20μL，检测波长为238nm。