[发明专利]一种吸水链霉菌的谷氨酰胺转胺酶酶原基因及其表达

权利要求书

1.一种来源于吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)CCTCC M203062的谷氨酰胺转胺酶酶原，其基因核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

2.如权利要求1所述的谷氨酰胺转胺酶酶原，其氨基酸组成为SEQ IDNO：2。

3.如权利要求1所述的谷氨酰胺转胺酶酶原的表达，其特征是：

(1)吸水链霉菌的谷氨酰胺转胺酶基因的获得

通过NCBI基因库查到平板链霉菌(Streptomyces platensis)，茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)，肉桂链霉菌(Streptomyces cinnamoneus)，弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)的谷氨酰胺转胺酶完整氨基酸序列，根据文献报道结果找到酶原起始序列和终止序列，然后通过比对相应碱基序列；另一方面在纯化获得来源于天然吸水链霉菌的酶原之后，通过N端氨基酸测序；确定PCR的引物如下：

P1：5’-GCTAGCGGTGACGACGAGG-3’

P2：5’-TTACGGCCAGCCCTGCTTTAC-3’

利用上述引物，以提取的吸水链霉菌CCTCC M203062总DNA为模板，PCR反应在50μL体系中进行，反应条件为在95℃变性5min后开始循环，然后95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，共35个循环后，再于72℃延伸10min；通过PCR扩增得到1170bp的DNA片段，编码389个氨基酸；测序结果在NCBI利用Blast分析，结果显示该基因序列与其它链霉菌产谷氨酰胺转胺酶的基因序列同源性最高达92％，Blast RID：7A2RYJJS015；

(2)谷氨酰胺转胺酶酶原基因的克隆

将扩增得到的DNA利用上海生工UNIQ-10柱式胶回收试剂盒回收纯化，将纯化产物4.5μL，pMD-18T载体0.5μL，按照试剂盒操作，16℃连接12小时，连接产物热击转化大肠杆菌JM109，操作如下：

1)将JM109感受态细胞从-80℃冰箱取出迅速放在冰上，溶化5min；

2)10μL连接产物加入至100μL JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟；

3)42℃加热90秒钟后，再在冰中放置3分钟；

4)加入950μL37℃预热的SOC培养基，37℃振荡培养90分钟；

5)在含有0.04mg/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷、0.024mg/mL异丙基-β-D-硫代半乳糖苷、0.1mg/mL氨苄青霉素的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落；

6)16h后，挑选白色菌落，  挑出的菌落接种于含有0.1mg/mL氨苄青霉素的LB培养基，37℃培养过夜，利用上海生工UNIQ-10柱式质粒抽提试剂盒操作得到含有目的基因的质粒pMD/pro-MTG；

(3)吸水链霉菌谷氨酰胺转胺酶的表达

利用限制性内切酶NcoI和BamHI从pMD/pro-MTG双酶切切下，将表达载体pET20b也同样双酶切，然后利用T4DNA连接酶进行连接反应，将连接产物先转化大肠杆菌JM109，得到正确的表达质粒pET/pro-MTG后再将表达质粒转化BL21(DE3)或Rosetta(DE3)pLysS，得到含有表达质粒pET/pro-MTG的工程菌命名为BL21/pET-MTG或Rosetta/pET-MTG；

诱导表达按下面操作进行：

1)将甘油管保存的BL21/pET-MTG或Rosetta/pET-MTG菌液0.1ml快速加入到装有25ml含有0.1mg/mLAmp的LB培养基的50ml三角瓶中，200rpm种子培养过夜；

2)按3％的接种量将种子分别接种到三个装有50ml含有0.1mg/mL Amp的LB培养基的250ml三角瓶中，37℃，200rpm培养4h；

3)加入终浓度为0.4mM IPTG，降低温度至24℃诱导4h；

4)取3mL步骤3)处理后的发酵液12000rpm离心2min，发酵液上清几乎没有酶活；离心沉淀用pH8.0的1.0mL Tris-HCl缓冲液悬浮，悬浮液经过超声破壁，12000rpm离心5min，离心上清有可溶性的酶原存在，经过胰蛋白酶100U/ml37℃处理10分钟后，最高酶活达到0.14U/mL；

5)对发酵上清液、破壁沉淀、破壁上清液，分别进行蛋白电泳SDS-PAGE表达产物的分布：胞外几乎没有可溶性谷氨酰胺转胺酶酶原，胞内有少量可溶性谷氨酰胺转胺酶酶原，大部分为不可溶的包涵体。