[发明专利]初生仔猪腹泻病的大肠杆菌基因工程疫苗K88－K99－LT及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及初生仔猪腹泻病大肠杆菌疫苗的研制，属于畜牧兽医技术领域。

背景技术

由特定血清型产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)引起的初生仔猪腹泻(Neonatal diarrhea)是导致初生仔猪死亡的一种重要传染病。初生仔猪腹泻多表现为突然发病，拉黄色水样粪便，迅速脱水和电解质失衡。发病猪可在几小时内死亡，有的仔猪没有出现腹泻就已经死亡。特定血清型的大肠杆菌是引起初生仔猪腹泻的主要病原，其主要产生F4(K88)、F5(K99)、F6(987P)和F41四类黏附素，同时可产生耐热肠毒素(heat-stable enterotoxin，ST)或/和不耐热肠毒素(heat-labile enterotoxin，LT)。鉴于K88、K99、987P、F41四类粘附素在致初生仔猪腹泻大肠杆菌的高出现率及ST、LT间较高的相关性，可以认定上述六种抗原是致初生仔猪腹泻ETEC的主要致病因子。

在初生仔猪腹泻防治方面，目前，国内常用的预防初生仔猪腹泻的大肠杆菌基因工程疫苗是K88-K99二价苗，而流行病学调查的结果显示K88、K99、987P、F41、ST、LT是目前引起我国初生仔猪腹泻ETEC的主要毒力因子或保护性抗原，因此，要有效控制我国由ETEC引起的初生仔猪腹泻，应注重对上述全部6种毒力因子的基因工程疫苗的研制。临床上，可供选择的另外一种预防初生仔猪腹泻的大肠杆菌疫苗是菌体灭活苗，菌体灭活苗需加多个菌株，即便达到有限效果，每个菌株均需达一定浓度，几个菌株加在一起势必造成疫苗中细菌总浓度较高，不可避免地产生副作用，免疫效果有限。因此研制免疫保护效果好、副作用低的基因工程疫苗为大势所趋。国内外尚无将上述六种保护性抗原基因中的三种串联表达的基因工程疫苗产品。

发明内容

本发明的目的是提供一种可预防初生仔猪腹泻的基因工程疫苗K88-K99-LT。

本发明由K88的主要亚单位基因faeG片段、K99的主要亚单位基因fanC片段、LT的主要亚单位基因ltb片段和原核表达载体pGEX-6P-1串联组成。

经过一系列免疫保护试验，证明本发明对于预防初生仔猪腹泻，是一种高效的初生仔猪腹泻大肠杆菌基因工程疫苗，其安全性和免疫原性可靠。

本发明的第二个目的还在于发明一种上述基因工程疫苗K88-K99-LT的构建方法：

将扩增出的K88的主要亚单位基因faeG片段、K99的主要亚单位基因fanC片段、LT的主要亚单位基因ltb片段，按K88-K99-LT方式定向串联于原核表达载体pGEX-6P-1。

另，用于扩增K88的主要亚单位基因faeG片段的引物是：

P1：GTGGATCCTGGATGACTGGT

BamH I

P2：GTAAGCTTGTAATAAGTTATTGCTACG

HindIII

用于扩增K99的主要亚单位基因fanC片段的引物是：

P3：AAGCTTAATACAGGTACTATTAACTTCAATG

HindIII

P4：GTCGACCATATAAGTGACTAAGAAGGAT

Sal I

用于扩增LT的主要亚单位基因ltb片段的引物是：

P5：GTCGACGCTCCCCAGACTATTACAGAAC

Sal I

P6：CTCGAGCTACCGTTAGTCATACTTTTTGCT

Xho I

本发明依据已公开的faeG(K88)、fanC(K99)、ltb(LT)亚单位的基因序列，设计含特异酶切位点的引物；以致初生仔猪腹泻大肠杆菌的质粒或基因组DNA为模板，采用PCR法扩增出上述保护性抗原基因；将上述基因定向串联于表达性质粒pGEX-6P-1，经转化宿主菌BL21后，进行IPTG 诱导表达，并经SDS-PAGE和Western-blot证明目的基因确已表达；再将表达上述3种保护性抗原基因的重组菌BL21(pFFLTB)免疫小鼠，评价其免疫原性及安全性。