[发明专利]PCR高通量构建siRNA全位点分子库制备方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种siRNA分子库制备方法。

背景技术：

siRNA(small interfering RNA：小片段干扰核糖核酸)是双链短小核酸碱基片断，一般功能长度为19-23bp。其作用是与特定靶基因mRNA结合引起同源mRNA特异性降解失去功能。这种双链介导的高效转录的基因沉默现象称之为RNAi(RNA interference：核糖核酸干扰)，是自然存在于细胞的防御能力：双链RNA进入细胞内被体内Dicer酶切割成21-23个核酸碱基片断的siRNA，先与细胞内的其他成分结合成一个核酸复合体而形成RNA诱导沉默复合体(RNA induced silencing complex，RISC)。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA上并切割而导致mRNA降解，从而清除细胞内特定的基因表达而发挥作用。siRNA不仅广泛应用于生物医学研究，而且在治疗多种疾病如病毒感染、肿瘤、血管神经系统疾病等具有广阔的前景。它是继单克隆抗体之后的一种划时代的能用于治疗多种疾病的生物药分子类型，是当今靶向性基因药物开发的热点。

RNAi靶向性基因药物开发的第一步就是在靶基因的众多的siRNA分子中筛选siRNA的最佳结合位点-即靶点(通常指该基因的沉默效率最高，结构最稳定的且与别的基因不同源的siRNA)。筛选样本中的siRNA分子的代表性和多样性至关重要。靶基因的siRNA是否能多，快，好，省的合成直接影响到RNAi靶向性基因药物开发的进展。

纵观siRNA合成方法可分两大类：即化学合成和生物合成。

siRNA化学合成是用核酸合成仪直接合成核酸碱基片断。可以直接合成RNA碱基小片段(siRNA)或先合成DNA碱基小片段，再克隆到siRNA表达载体，利用载体的RNA聚合酶III启动子(U6或/和H1)在细胞内将DNA片段转录成siRNA。直接合成RNA碱基片段费用昂贵而且RNA片段不能直接进入细胞内发挥作用，必需外加其它的化学修饰才能跨膜传输到细胞内。先合成DNA碱基小片段再克隆到siRNA表达载体细胞内表达，因涉及分子克隆过程，在众多siRNA分子合成时量化极其困难。除此之外，在选择哪段序列进行合成上一直存在盲点。siRNA的最佳靶点是很难被电脑程序“猜”到的。

siRNA生物合成是利用生物酶以全长双链cDNA或双链RNA为底物的一系列催化反应而实现的。而合成的siRNA是分子库的形式出现，理论上具有全部siRNA分子，是靶点筛选的良好工具。

以双链RNA(dsRNA)为底物是凭借T7RNA聚合酶以DNA为摸板在体外转录制备长双链RNA片断，然后用Dicer酶直接将其切割成短小RNA片断。Dicer酶是核糖核酸酶III(Ribonuclease III，RNase III)家族的成员，广泛存在于蠕虫真菌物及哺乳动物细胞内。体外重组Dice酶利用Dicer酶直接将其切割成21-23bp短小RNA片断，模仿体内自然的RNA干扰起始阶段，该酶在市场上已有销售(Ambion，USA)。Dicer酶得到一群siRNA分子，这种siRNA混合物就可以直接转染细胞，方法和单一的siRNA转染一样。由于siRNA“群”有许多不同的位点的siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。这种方法有两个缺点：1)短小RNA片断不可能再逆转录成cDNA，无法加以克隆，导致无法分离siRNA“群”中的RNAi分子，无法进行siRNA药物靶点的筛选。2)siRNA分子群体一并投入，容易引发非特异的基因沉默。

以DNA模板(靶基因cDNA；总体cDNA或基因组DNA)构建siRNA分子库可以将siRNA分子各种位点一并加以克隆，克服上述双链RNA为底物的瓶颈，不但可以用于高通量的siRNA介导的功能基因组研究，更重要的是便于实行RNAi基因治疗最佳靶点的筛选。但Dicer酶无法作用于cDNA模板，目前报道的以DNA模板构建siRNA分子库方法都通过II型限制性内切酶Mmel实现的。Mmel能识别和限定切割其相邻任意18-20个核苷酸序列，是II型限制性内切酶的最长识别位点，无法模仿体内Dicer酶自然形成的21-23bp siRNA片断，在实行RNAi基因治疗最佳靶点的筛选上存在盲点与瓶颈。