[发明专利]一种准确简便的蓑羽鹤性别鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种准确简便的蓑羽鹤性别鉴定的方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

性染色体连锁的EE0.6(0.6kb-EcoRI-fragment)基因是从鸡的W染色体克隆而来的，是一段单一序列，在目前已被检测过的平胸和非平胸鸟类中都是保守的，可以选择合适的引物对Z、W染色体上的同源拷贝进行特异性扩增来鉴定性别。由于雌性为ZW型，雄性为ZZ型，因此对PCR扩增产物电泳检测时，可在雌性得到不同长度的片段，而雄性只能得到相同长度的片段。Itoh等(2001)通过利用EE1和EE4引物组合、EE2和EE3引物组合对EE0.6基因上的片段进行扩增来鉴定丹顶鹤、白枕鹤、蛇鹫、东方白鹳等数种鸟类的性别，并获得了较好的结果；陈武等(2006)利用单对引物分别对W和Z染色体上的同源序列进行特异性扩增，也成功地对丹顶鹤、戴冕鹤、黑鹳等几种鸟类的性别进行了鉴定。

目前，作为一种简便的性别鉴定方法，应用EE0.6对鸟类，尤其是蓑羽鹤进行性别鉴定的研究很少，比较常用的是CHD基因，即染色体螺旋蛋白基因(Chromobox-heli-case-DNA binding gene)，EE0.6基因这两对引物组合的应用也很少。

发明内容

本发明的目的是提供一种准确、操作简便、可重复性强的蓑羽鹤性别鉴定的方法。

本发明的技术方案是：先通过两对引物组合对蓑羽鹤基因组DNA的W、Z染色体上的特异序列进行扩增，再经1.5％琼脂糖凝胶电泳，用Gene Genius凝胶成像仪进行拍照记录，根据带型判断性别：雌性为两条带，雄性为一条带；

所述两对引物组合为：EE1(5’-ACAGTTTGTCTGTCTCCGGGGAA/AGCTGGAYTTCAGWSCATCTTCT-3’)、EE2(5’-TAGGCTGCAGAATACAGCAT/TTGTGCAGTTCTAGTCCATA-3’)和EE3(5’-CACCCTGGATTGGACAACCTATTTC/TCAGAGCACTCTTTCCAGGAA-3’)、EE4(5’-AAGCATAGAAACAATGTGGGAC/AACTCTGTCTGGAAGGACTT-3’)。

本发明利用对EE0.6基因在W、Z染色体上的特异序列的扩增所产生的不同带型来判断蓑羽鹤性别。本发明无需特殊的仪器要求，只需要掌握一般的PCR和琼脂糖凝胶电泳的操作，就可进行简便的鉴定，可重复性强，简便易行。采用两个引物组合EE1和EE2组合、EE3和EE4组合，对蓑羽鹤的性连锁基因EE0.6在W和Z染色体上的特异片段进行扩增鉴定其性别，证明了EE0.6基因在鹤中是保守的，这两对引物组合可以准确地鉴定蓑羽鹤的性别。利用分子方法对蓑羽鹤进行性别鉴定，能尽量减小对蓑羽鹤的伤害，尽早将繁殖期的蓑羽鹤进行配对，保证人工繁殖和人工育种的正确进行，方便不同动物园和保护区之间蓑羽鹤的交流。本发明所采用的引物组合同样适合于其它非平胸鸟类的性别鉴定。

本发明在对蓑羽鹤基因组DNA的W、Z染色体上的特异序列进行扩增时，采用10μL体系：取0.5 U Taq DNA聚合酶、1.5mM MgCl₂、200μM dNTP、4pmol引物和100ng蓑羽鹤基因组DNA，加双蒸水补至10μL。

蓑羽鹤基因组DNA的提取方法是有所改进的酚-氯仿萃取法：

取抗凝血30μL于1.5mL离心管中，加入300μL裂解液，裂解24小时后，加入6μL蛋白酶K和2μL RNase，55℃水浴10～15小时后，分别加等体积的饱和酚、苯酚-氯仿-异戊醇混合液和氯仿-异戊醇混合液各抽提一次，留上清，加冰无水乙醇沉淀DNA，70％酒精洗涤，干燥，TE溶解，4℃保存备用。

附图说明

图1为EE1和EE2引物组合对蓑羽鹤的性别鉴定结果(一条带为雄性，两条带为雌性)。

图2为EE3和EE4引物组合对蓑羽鹤的性别鉴定结果(一条带为雄性，两条带为雌性)。

具体实施方式

1、采用有所改进的酚-氯仿萃取法提取蓑羽鹤基因组DNA：

取抗凝血30μL于1.5mL离心管中，加入300μL裂解液(2M尿素，100mM Tris-HCl，100mM EDTA，1％SDS，pH8.0)裂解一天后，加入6μL蛋白酶K(PrK，浓度为5μg/μL)和2μLRNase(浓度为2.5μg/μL)，55℃水浴10～15小时。