[发明专利]硝酸测定试剂盒及硝酸浓度测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种硝酸测定试剂盒，同时本发明还涉及测定硝酸浓度的方 法，属于食品/环境检验测定技术领域。

背景技术

亚硝酸盐主要指亚硝酸钠，亚硝酸钠为白色至淡黄色粉末或颗粒状，味微 咸，易溶于水。外观及滋味都与食盐相似，并在工业、农业、食品、建筑业 中广为使用，由亚硝酸盐引起食物中毒的机率较高。1995年版中华人民共和 国药典对蒸馏水检测增加了硝酸盐与亚硝酸盐检查。亚硝酸盐可被氧化变为 硝酸盐，硝酸盐在无氧环境中受微生物的作用还原为亚硝酸盐，是致癌物质。

目前有按照国标GB/T5009.33做成的试剂盒，与标准色卡来比较进行定 量，然而按照国标方法检测亚硝酸盐指标，步骤繁琐，而且有些试剂必需现 配现用，费时又费力。它的检测原理：在酸性溶液中亚硝酸盐与对氨基苯磺 酸作用生成重氮化合物，再与α-萘胺起偶合反应，生成紫红色偶氮染料，显 色深浅与亚硝酸盐含量成正比。加入锌粉的目的是将硝酸盐还原成亚硝酸盐。

紫外分光光度法的原理：硝酸根离子在紫外区有强烈的吸收，利用它在 220nm波长处的吸光度可定量测定硝酸盐。氯化物在此波长不干扰测定，溶解 的有机物在220nm处也会有吸收，而硝酸根离子在275nm处没有吸收。因此， 在275nm处作另一次测量，以校正硝酸盐值。紫外分光光度法操作过程简单。

还有利用离子色谱法紫外测定海水中亚硝酸盐、硝酸盐，这是利用离子色 谱法结合紫外检测的方法。其他还有主要对肉制品、乳制品和蔬菜中亚硝酸 盐检测的光度法(格里斯试剂比色法、催化(褪色)光度法、流动注射-分光光 度法、顺序注射-分光光度法、导数光度法)、示波极谱法、荧光法等。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm 波长处吸光度的变化，得以测定硝酸浓度的方法，同时，本发明还将给出用 以实现该方法的硝酸测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪 或半、全自动生化分析仪上进行硝酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高， 因而可以得到切实的推广应用。

本发明硝酸浓度测定方法原理如下：

硝酸+还原型辅酶 硝酸还原酶 亚硝酸+水+辅酶

这种方法应用硝酸还原酶(Nitrate reductase；EC1.7.1.1；EC1.7.1.2；EC 1.7.99.4)酶促反应连续监测法/终点比色法。硝酸还原酶酶解硝酸反应，最终 将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收 峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的程度/速度，通过测 量340nm处吸光度下降的程度/速度，可以测算硝酸的浓度大小。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无 论是单剂、双剂，如下成分关系的本发明硝酸测定试剂盒较为理想：

缓冲液                     100mmol/L

稳定剂                     500mmol/L

还原型辅酶                 0.25mmol/L

硝酸还原酶                 10000U/L

本发明的硝酸测定试剂盒可以是单剂，包括：

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、硝酸还原酶。

试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试 剂，直接使用。

也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶。

试剂2

缓冲液、稳定剂、硝酸还原酶。

还原型辅酶、硝酸还原酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可 以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使 用。

无论是单剂、双剂，本发明测定硝酸浓度的方法，其还原型辅酶可以是 NADPH、NADH或thio-NADH中的一种。

具体实施方式

下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一

本实施例的硝酸测定试剂为单试剂，包括：