[发明专利]L－苹果酸诊断/测定试剂盒及L－苹果酸的浓度测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种L-苹果酸诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定L-苹果酸浓度的方法，属于医学/食品检验测定技术领域。

背景技术

苹果酸有D-苹果酸、DL-苹果酸和L-苹果酸。L-苹果酸又名2-羟基丁二酸，是生物体三羧酸的循环中间体，易被人体吸收，因此作为性能优异的食品添加剂和功能性食品广泛应用于食品、化妆品、医疗和保健品等领域。L-苹果酸中含有天然的润肤成分，可以清除皮肤表面皱纹，使皮肤变得嫩白、光洁而有弹性，因此在化妆品配方中备受青睐；L-苹果酸可以配制多种香精、香料，用于多种日用化工产品，如牙膏、洗发香波等；国外将其用于替代柠檬酸作为新型洗涤助剂，用于合成高档特种洗涤剂。L-苹果酸可用于药物制剂、片剂、糖浆中，还可以配入氨基酸溶液中，能明显提高氨基酸的吸收率；L-苹果酸可以用于治疗肝病、贫血、免疫力低下、尿毒症、高血压、肝衰竭等多种疾病，并能减轻抗癌药物对正常细胞的毒害作用；还可用于制备和合成驱虫剂、抗牙垢剂等。另外L-苹果酸还可以作为工业清洗剂、树脂固化剂、合成材料增塑剂、饲料添加剂等。

中华人民共和国国家标准GB 13737-92有关食品添加剂L-苹果酸的检测是用苹果酸氨盐呈色试验，是用化学方法显色。另外，还有利用高锰酸钾化学发光体系测定了DL-苹果酸。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)技术，计量/连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定L-苹果酸浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的L-苹果酸诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行L-苹果酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明L-苹果酸浓度测定方法原理如下：

L-苹果酸+辅酶  苹果酸脱氢酶  草酰乙酸+还原型辅酶

这种方法应用苹果酸脱氢酶(Malate dehydrogenase；EC 1.1.1.37)酶促反应速率比色法/终点法。苹果酸脱氢酶酶解L-苹果酸反应同时将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的程度/速度，通过测量340nm处吸光度上升的程度/速度，可以测算L-苹果酸的浓度大小。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂，如下成分关系的本发明L-苹果酸诊断/侧定试剂盒较为理想：

缓冲液          100mmol/L

稳定剂          500mmol/L

辅酶            3mmol/L

苹果酸脱氢酶    10000U/L

本发明的L-苹果酸诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括：

缓冲液、稳定剂、辅酶、苹果酸脱氢酶。

试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、辅酶。

试剂2

缓冲液、稳定剂、苹果酸脱氢酶。

辅酶、苹果酸脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

无论是单剂、双剂，本发明测定L-苹果酸浓度的方法，其辅酶可以是NADP⁺、NAD⁺或thio-NAD⁺中的一种。

具体实施方式

下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。

实施例一

本实施例的L-苹果酸诊断/测定试剂为单试剂，包括：

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L

稳定剂                           500mmol/L

辅酶                             3mmol/L

苹果酸脱氢酶                     10000U/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。