[发明专利]草酸诊断/测定试剂盒及草酸浓度测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种草酸诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定草酸浓度的方法，属于医学/食品检验测定技术领域。

背景技术

草酸作为一种最简单的二元羧酸，普遍存在于植物界中，植物草酸具有重要的生理功能，并且在植物抗逆性中发挥积极作用。草酸多以钾盐或钙盐的形式存在，而在秋海棠、芭蕉中却以游离酸的形式存在，草酸有毒，能溶解于水。草酸是一种重要的化工原料，广泛用于医药、染料、涂料、稀土金属的分离和提纯以及衣物的漂白。

测定草酸的方法有：离子色谱法、电导离子色谱法、HPLC方法。临床上大多数结石属草酸钙结石。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及偶联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定草酸浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的草酸诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行草酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明草酸浓度测定方法原理如下：

草酸+氧草酸氧化酶二氧化碳+过氧化氢

二氧化碳++还原型辅酶甲酸脱氢酶甲酸+辅酶

这种方法应用草酸氧化酶(oxalate oxidase；EC 1.2.3.4)偶联甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase；EC 1.2.1.2；EC 1.2.1.43)酶促反应连续监测法/终点比色法。草酸氧化酶酶解草酸反应产生二氧化碳，再通过偶联甲酸脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的程度/速度，通过测量340nm处吸光度下降的程度/速度，可以测算草酸的浓度大小。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明草酸诊断/测定试剂盒较为理想：

缓冲液               100mmol/L

稳定剂               500mmol/L

还原型辅酶           0.25mmol/L

草酸氧化酶           10000U/L

甲酸脱氢酶           12000U/L

本发明的草酸诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括：

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酸氧化酶、甲酸脱氢酶。

试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶。

试剂2

缓冲液、稳定剂、草酸氧化酶、甲酸脱氢酶。

还原型辅酶、草酸氧化酶、甲酸脱氢酶、在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶。

试剂2

缓冲液、稳定剂、甲酸脱氢酶。

试剂3

缓冲液、稳定剂、草酸氧化酶。

还原型辅酶、草酸氧化酶、甲酸脱氢酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定草酸浓度的方法，其还原型辅酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH中的一种。

具体实施方式

下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。

实施例一

本实施例的草酸诊断/测定试剂为单试剂，包括：

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液  100mmol/L

稳定剂                         500mmol/L

还原型辅酶                     0.25mmol/L

草酸氧化酶                     10000U/L

甲酸脱氢酶                     12000U/L