[发明专利]蔗糖酶诊断/测定试剂盒及蔗糖酶活性浓度测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种蔗糖酶诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定蔗糖酶活性浓度的方法，属于医学/食品检验测定技术领域。

背景技术

蔗糖酶(sucrase)的功能为将蔗糖水解成D-果糖和D-葡萄糖，又称为转化酶(invertase)或蔗糖酶(saccharase)。蔗糖酶-异麦芽糖酶缺乏，已知人类一旦缺少其中一种酶，就会产生对二糖无耐性的遗传病，有可能它们是同在一个蛋白质上，属单基因控制。蔗糖酶在高等植物蔗糖代谢中起着关键的作用。

蔗糖酶的检测方法有：(1)Nelson法，其原理是：蔗糖酶可将蔗糖水解为葡萄糖和果糖，而葡萄糖在碱性溶液中能将Cu²还原；砷钼酸试剂与氧化亚铜生成蓝色复合物(砷钼蓝)，在510nm波长下有正比于还原糖浓度的光密度，从而确定蔗糖酶的浓度。(2)水杨酸法：蔗糖酶能使蔗糖水解成葡萄糖和果糖，葡萄糖与3，5-二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定浓度范围内，葡萄糖的量和棕红色物质颜色深浅程度成一定比例。(3)用邻甲苯胺试剂比色测定。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定蔗糖酶活性浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的蔗糖酶诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行蔗糖酶活性浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明蔗糖酶活性浓度测定方法原理如下：

蔗糖蔗糖酶D-葡萄糖+D-果糖

D-果糖+还原型辅酶甘露醇脱氢酶甘露醇+辅酶

这种方法应用蔗糖酶(sucrase；EC 3.2.1.48)偶联甘露醇脱氢酶(Mannitol dehydrogenase；EC 1.1.1.138；EC 1.1.1.67)酶促反应连续监测法。蔗糖酶酶解蔗糖反应产生果糖，再通过偶联甘露醇脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算蔗糖酶的活性浓度大小。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明蔗糖酶诊断/测定试剂较为理想：

缓冲液          100mmol/L

稳定剂          500mmol/L

还原型辅酶      0.25mmol/L

蔗糖            30mmol/L

甘露醇脱氢酶        10000U/L

本发明的蔗糖酶诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括：

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、甘露醇脱氢酶、蔗糖。

试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、蔗糖。

试剂2

缓冲液、稳定剂、甘露醇脱氢酶。

还原型辅酶、甘露醇脱氢酶、蔗糖在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶。

试剂2

缓冲液、蔗糖。

试剂3

缓冲液、稳定剂、甘露醇脱氢酶。

还原型辅酶、甘露醇脱氢酶、蔗糖在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定蔗糖酶活性浓度的方法，其还原型辅酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH中的一种。

具体实施方式

下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。

实施例一

本实施例的蔗糖酶诊断/测定试剂为单试剂，包括：