[发明专利]苹果酸浓度的测定方法及苹果酸诊断试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及医药、食品、环境等领域内对苹果酸浓度的检测，尤其涉及双倍扩增法、酶比色法及酶联法测定苹果酸浓度的方法，以及由此制得的苹果酸诊断试剂盒，属于苹果酸浓度分析检测技术领域。

背景技术

传统的分离和测定苹果酸的方法是气相色谱法，但分析苹果酸时必须先进行衍生化，从而会影响分析的过程和结果。离子色谱法(IC)和高效液相色谱法(HPLC)是近年来测定苹果酸采用比较多的方法，但是样品处理较为复杂；苹果酸的HPLC含量测定采用Zorbax-sbC18色谱柱，HPLC分析苹果酸的线性范围为0.280～9.020ug。基质固相分散是一种新样品处理技术，浓缩了传统样品均化，组织细胞裂解、提取、过滤、净化等过程，使样品的预处理变得简便，同时也避免了目标物的损失。

酶法分析是国际上公认的苹果酸的分析方法，已被多个国际权威组织或机构采纳：如IFU(国际果汁生产者协会)，AIJN(欧盟果蔬汁及饮料生产者联盟)，及MEBAK，OICC，VDLUFA等组织广为推崇，并确定为标准检测方法。已被写入澳大利亚、荷兰、德国、瑞士等多个国家的食品法。

发明内容

本发明的目的是提供一种测定苹果酸浓度的方法，以及应用该方法配制而成的苹果酸诊断试剂盒。

为实现本发明的目的，一种双倍扩增法、酶比色法及酶联法测定苹果酸浓度的方法，利用苹果酸脱氢酶即为作用酶又是显色酶、丙酮酸脱氢酶为显色酶，对待测样品中的苹果酸进行检测，采用以下步骤进行：

首先，将测定的样品与含有苹果酸脱氢酶、辅酶、丙酮酸脱氢酶、辅酶A的试剂混匀，使之发生以下反应，

然后，将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，测算出苹果酸浓度的大小。

上述双倍扩增法、酶比色法及酶联法测定苹果酸浓度的方法中，所述辅酶是NADP⁺、NAD⁺或thio-NAD⁺中的一种。

实现本发明苹果酸诊断试剂盒可以是单剂，由以下成分组成：

缓冲液          20～500mmol/L，

稳定剂          1～4000mmol/L，

辅酶            1～6mmol/L，

辅酶A           1～50mmol/L，

苹果酸脱氢酶    1000～80000U/L，

丙酮酸脱氢酶    1000～80000U/L。

试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

也可以将以上单剂中的各种成分进行组合配制成双剂，比如：