[发明专利]一种花特异性启动子、表达盒及其植物表达载体

说明书

一、技术领域

本发明涉及花卉基因工程，更确切的说，本发明涉及分离得到的康乃馨(Dianthus caryophyllus L.)CMB2基因的启动子，其能够驱动一个多核苷酸序列或目的基因在植物的花器官中高水平表达，而不在根茎叶(包含但不仅限于)等营养器官中表达。

二、背景技术

康乃馨由于高度杂合，因而现代商业上比较成功的品系一般都是将品质较好的个体进行无性繁殖以保持其优良的形状。作为一种观赏性作物，花色、花香、花型、延长瓶插期是育种的重要目标。选择优良的品系，将可以改变花的性状的目的基因转入康乃馨，为培育新奇，美丽，持久的康乃馨鲜切花品系提供了新的途径。

而目前在花卉分子育种中基本上都采用组成型表达启动子，它可以使外源基因在植物中高效表达^[1]。由于组成型启动子驱动的基因在植物各组织中均有不同程度表达，应用中逐渐暴露出一些问题。例如外源基因在整株植物中表达，产生大量异源蛋白质或代谢产物在植物体内积累，打破了植物原有的代谢平衡，有些产物对植物并非必需甚至有毒，因而阻碍了植物的正常生长，甚至导致死亡。另外，重复使用同一种启动子驱动两个或两个以上的外源基因可能引起基因沉默或共抑制现象^[2]。

因此，有必要在花卉基因工程中采用花器官特异性启动子，这样既可以使外源基因在花器官中高效表达，又能在最大限度上不影响植物体的正常生长发育。

目前，已经克隆的只在花器官中且在花瓣中优势表达的启动子非常少。矮牵牛CHSA和CHSJ的启动子驱动报告基因在矮牵牛的花冠筒，花冠，胚珠，花梗，心皮中表达，而不在叶片和茎中表达^[3]。来源于矮牵牛的fbpl基因属于MADSbox基因，fbpl启动子驱动报告基因只在矮牵牛的花瓣和雄蕊中表达，而且直到花开放时仍然维持高水平的表达^[4]。Arnaud G.Bovy等将fbpl启动子报告基因融合载体进行康乃馨转基因，发现fbpl启动子在康乃馨中的异源表达也是花瓣和雄蕊特异性的^[5]。从Clarkia breweri中克隆的S-芳樟醇合酶(S-linalool synthase)启动子驱动报告基因在异源植物矮牵牛和金盏花的花瓣，雄蕊，雌蕊中高效表达[6](PCT/US2003/006296)。来源于单子叶植物玉米的P基因的启动子驱动报告基因只在玉米的花器官中表达，在根茎叶中均检测不到报告基因的表达(PCT/US1997/021507)。佛罗里达大学从拟南芥和矮牵牛中开发的启动子只驱动报告基因在花器官中表达(PCT/US2004/022343)。

目前，已经研究的可用于花卉基因工程的花特异性启动子很少，而且有大多都申请了专利。从一个物种克隆得到的花特异性启动子，由于物种特异性的原因，应用于其它植物时，可能并不能驱动外源基因的花特异性表达。因此最好能够使用转基因目的物种本身的花特异性启动子，或者在使用异源启动子时，首先验证其表达特异性。因此，尽管在所属领域已经克隆了一些花特异性的启动子，但是需要发现使用于不同植物的具有有益表达特征的新型启动子。

在花卉基因工程中，对花器官的改良是最重要的目标，并且希望在花开时能表现出最佳的状态。因此，花卉基因工程育种迫切需要的一项工作——克隆高效表达的花特异性启动子，尤其是在花开放后仍能高效表达的启动子。

三、发明内容

本发明自主克隆了一个可用于花卉基因工程育种的花特异性启动子，这样一个启动子可以驱动目的基因在康乃馨等花卉的花器官中高效表达，而不影响根茎叶的发育。

本发明采用锚定PCR(APCR)和反向PCR(IPCR)基因克隆方法，经过两次染色体步移，克隆了康乃馨花器官特异表达基因CMB2的翻译起始位点上游调控序列3080bp。

本发明根据已经得到的康乃馨CMB2基因及其3080bp的上游序列，设计一对引物扩增一段长度为2688bp的序列片段(包含CMB2基因翻译起始位点之前2510bp及之后的178bp)，克隆到T载体中，命名为LP4，所有启动子缺失片段都从这个质粒经PCR扩增得到。质粒LP4中所对应的序列即为序列表中SEQID NO：1的DNA序列。