[发明专利]一种人乳腺癌细胞系SK－3rd及其建立方法

权利要求书

1. 一种人乳腺癌细胞系SK-3rd，其特征在于采用人乳腺癌SK-BR-3细胞株作为源细胞，且其含有肿瘤干细胞的比例高于源细胞SK-BR-3。

2. 根据权利要求1所述的人乳腺癌细胞系SK-3rd，其特征在于：

1)体外生长具有典型的上皮样形态，接触性生长抑制消失，染色体呈三倍体或亚三倍体核型，染色体数目50～69条，占总数的80％左右，染色体结构畸变，多条染色体发生易位或缺失突变；microRNA芯片检测发现，52种microRNAs表达降低，其中let7家族成员降低最明显、最稳定；

2)通过球囊形成率及球囊长期培养的情况来评价细胞系中具有自我更新能力的癌干细胞。1ml培养体系中1000个细胞悬浮培养15天后，SK-3rd细胞的球囊形成率为15.2％～18.1％(16.3％±1.2％)，大约是SKBR3细胞的20倍；单细胞培养15天时观察1000个培养体系，SK-3rd细胞形成的球囊形成率为11.4％～18.3％(14.4％±2.8％)，是SK-BR-3的18倍；SK-3rd细胞形成的球囊可以长期培养，至少可以传代50代，而SKBR3细胞形成的球囊传3-4代后就很难再形成球囊了；

3)SK-3rd细胞形成的球囊细胞不表达肌上皮标志物CK14及导管上皮标志物CK18，处于未分化状态；

4)SK-3rd细胞形成的球囊细胞具有癌干细胞的表型，这些表型在其分化的过程中逐渐消失；

5)NOD/SCID鼠原位移植成瘤率高、远处转移率高、成瘤周期短、成瘤所需的细胞数目少。

3. 一种人乳腺癌细胞系的建立方法，它包括：

1)按照常规方法建立人乳腺癌NOD/SCID鼠原位移植瘤模型

取呈对数生长期的乳腺癌细胞株SK-BR-3，胰蛋白酶消化，计数后PBS重悬，将2×10⁶个细胞，共100μl，接种于4～6周的雌性NOD/SCID鼠胸部右侧第二对乳房垫；

2)待肿瘤可触及后，尾静脉注射表阿霉素，8mg/kg，每周一次，直至肿瘤生长至直径20mm；

3)把经处死、消毒处理后取出的小鼠肿瘤组织切成小块，在恒温水浴中经胰蛋白酶消化大约20～40分钟，37℃，100rpm，至肉眼观肿瘤组织块消化完全，无明显组织块为止，300目筛网过滤后将单细胞悬液PBS重悬，取2×10⁶个细胞，共100μl接种于NOD/SCID鼠胸部右侧第二对乳房垫；

4)重复上述步骤，共接种3次，每次均采用同样方法尾静脉注射表阿霉素；

5)建立细胞系：将肿瘤组织用胰酶消化法制备成单细胞悬液，进行体外原代培养，培养液为高糖DMEM加20％(v/v)胎牛血清，37℃，5％CO2/95％空气，饱和湿度培养，隔天换培养液，每3～4天传代一次，传代后培养液中添加的胎牛血清改用10％；

6)系列实验检测，验证细胞特征。

4. 根据权利要求3所述的人乳腺癌细胞系的建立方法，其特征在于悬浮培养液为无血清培养基DMED-F12，添加的生长因子有B27、20n/mL EGF、5μg/mL insulin、及0.4％BSA。