[发明专利]携带C57BL/6鼠端粒酶逆转录酶的重组腺病毒载体

说明书

技术领域

本发明涉及腺病毒载体，尤其涉及一种携带C57BL/6鼠端粒酶逆转录酶的重组腺病毒载体。

背景技术

细胞获得永生化，具有了无限增殖的能力，主要依赖于细胞内端粒酶的激活。自1994年kim等创立了端粒酶活性检测的端粒重复聚合酶链反应方法及在肿瘤组织中发现端粒酶活性以来，端粒酶已成为生命科学领域里研究热点。大量研究表明，各种类型的恶性肿瘤中都有不同程度地表达端粒酶的活性。由于肿瘤诊断和治疗最理想的靶点就是找到一种肿瘤细胞所具有、在正常细胞中不存在的物质基础，而端粒酶在肿瘤细胞中的激活并维持细胞的无限增殖能力，是恶性肿瘤细胞区别于正常细胞的重要特征之一，具备了作为肿瘤诊断和治疗物质基础的条件，因此，端粒酶已成为肿瘤研究的新热点，有望为肿瘤的诊断和治疗提供一种全新的途径。目前国内外提出的以端粒酶为靶点的肿瘤治疗策略，主要是以抑制端粒酶活性的方法为主。近来，国外提出更优越的新策略，即以肿瘤组织端粒酶激活为目标，以端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)启动子调控其它抗肿瘤基因，从而达到靶向肿瘤细胞并破坏肿瘤细胞的目的。

以端粒酶为基础的肿瘤免疫治疗与其他治疗方法相比有以下优势：第一，不需要为每一位患者确定具有其自身HLA类型的来源于肿瘤抗原的免疫原性抗原决定簇；第二，在所有肿瘤的治疗方案中，没有一项是可以针对所有肿瘤的，以端粒酶为靶点的治疗可以靶向90％以上的各种肿瘤，是目前最为广谱的肿瘤基因治疗方案。因此，以端粒酶为基础的肿瘤免疫治疗在肿瘤新发/复发的治疗上将有广泛的应用价值。

为研究端粒酶逆转录酶的生物学性能和其在肿瘤基因治疗中的作用，我们选用C57BL/6鼠为研究对象，C57BL/6鼠在生命科学领域是常用的试验动物，广泛地应用于肿瘤学、生理学、免疫学、核医学研究，以及单克隆抗体的制备等。同时利用腺病毒载体感染效率高、宿主范围广及安全性较好等特点，构建表达C57BL/6鼠端粒酶逆转录酶的重组腺病毒载体，为端粒酶逆转录酶基因的研究提供有效的生物表达体系。

本文所涉及的C57BL/6鼠，肝癌细胞Hepa1-6，穿梭质粒pAC，腺病毒重组质粒pJM17，人胚肾293细胞以及其它载体，试剂均为公开的商品化产品，在国内外均可购买到，在下文不作特殊说明。

发明内容

针对现有技术存在的缺点，本发明的目的在于提供一种携带C57BL/6鼠端粒酶逆转录酶重组腺病毒载体，克服目前抗肿瘤免疫研究转染效率低，抗肿瘤谱窄缺点。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：应用逆转录聚合酶链反应对C57BL/6鼠端粒酶逆转录酶基因编码区cDNA成功地进行了克隆和序列测定，获得了其编码区序列，在明确端粒酶逆转录酶基因表达与肿瘤发病密切相关的基础上，将C57BL/6鼠端粒酶逆转录酶克隆到复制缺陷型腺病毒中。

具体来讲：从与其同源的肝癌细胞Hepa1-6中提取总RNA，采用聚合酶链反应技术扩增C57BL/6鼠端粒酶逆转录酶的基因编码区序列，将序列定向克隆至真核表达载体，将此表达载体与腺病毒重组质粒共同转染人胚肾人胚肾293细胞，经同源重组产生重组腺病毒载体Ad-C57BL，纯化后的重组腺病毒载体Ad-C57BL在人胚肾293细胞大量扩增，纯化，测定病毒滴度。聚合酶链反应及酶切证实：C57BL/6鼠的端粒酶逆转录酶基因编码区正确克隆到穿梭质粒中，成功重组到腺病毒载体基因组，并在人胚肾293细胞中成功包装出具有感染活性的重组腺病毒Ad-C57BL。成功构建了C57BL/6鼠端粒酶逆转录酶基因重组腺病毒载体，为研究其用于肿瘤的基因治疗奠定基础。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的详细说明。

图1是pAC(+)载体图谱；

图2是pJM17质粒Hind III酶图谱；

图3是pAC(+)mTERT载体产生过程图；

图4是Adv-C57BL产生过程图；

图5是C57BL/6鼠肝癌细胞总RNA的提取结果图；

图6和图7是C57BL/6鼠端粒酶逆转录酶cDNA的RT-PCR扩增图；

图8和图9是PCRI和PCRII的双酶切鉴定图；

图10和图11是重组质粒plA、plB的酶切鉴定图；

图12是pAC/mTERT载体EcoR I和Hind III双酶切鉴定图；

图13是C57BL/6鼠端粒酶逆转录酶cDNA序列的部分测序结果图；

图14是pAC-mTERT载体EcoR I和Hind III双酶切鉴定图；