[发明专利]一种蛋白或多肽抗原的修饰方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种蛋白和多肽抗原的修饰方法及应用。

背景技术

吲哚胺2，3加双氧酶IDO在机体免疫自稳机制中有重要作用。系统抑制体内IDO活性，可导致多种自身免疫性疾病，甚至诱发子宫等免疫特惠器官的免疫排斥反应，如引起流产。2000年以来，在《Sciences》、《Nature》等重要学术期刊多次刊载IDO介入诱导免疫耐受的相关研究进展。Munn等证实：高表达IDO的CD123⁺CCR6⁺的DC具有明显抑制T细胞增殖活性的作用；Miki等发现：IDO参与抑制受鼠T细胞对主要组织抗原不符的同种肝移植的排斥反应。Grohmann等观察到IDO参与抑制小鼠自发性糖尿病自身抗原引起的T细胞反应。IDO特异性抑制1-甲基色氨酸(1-methyl-tryptophan，1-MT)能有效阻断这种抑制作用。1-MT可明显取消小鼠胰岛细胞移植中CTLA-4诱导的免疫耐受。与此同时，用重组IDO转染肿瘤细胞，Munn等观察到T细胞的抗原特异性增殖反应被明显抑制。

鉴于IDO在体内分布的广泛性和对机体正常免疫自稳机制的重要性，整体非特异性抑制IDO，也就是全身给予1-MT势必因破坏免疫自稳状态而导致机体内环境的紊乱。因此，本发明人认为只有实现对处理肿瘤抗原的树突状细胞DC内IDO的靶向性抑制，才具有真正的临床应用价值。

多肽合成的常用工艺方法是基于Merrifield创建并发展的多肽固相合成工艺的基础上的。修饰过程中需要对暂不参与形成酰胺键的氨基加以保护，并且对参与形成酰胺键的羧基进行活化。反应完成后再将保护基团除去。氨基保护法有Boc法和Fmoc法。Fmoc法是采用Fmoc即9-芴甲氧羰基基团作为α-氨基保护基，进行多肽的Fmoc固相合成。Fmoc基团在280nm-310nm之间呈现特征性紫外吸收的三重峰，易于监测反应的进行，通过对其在289nm的紫外吸收度可测知Fmoc基团浓度进而可计算出氨基酸的连接率。

将两个相应的氨基被保护的及羧基被保护的氨基酸放在溶液内，并不形成肽键.要形成酰胺键，经常用的手段是将羧基活化，其方法是将它变成混合酸酐，或者将它变为活泼酯、酰氯，或者用强的失去剂例如碳二亚胺也可形成酰胺键。

但是利用该工艺方法实现某种蛋白的修饰，而且蛋白及多肽抗原被修饰后，进入体内，能定向集中于进行肿瘤抗原处理的树突状细胞DC，并释放IDO的抑制剂以达到促进机体对肿瘤细胞的免疫作用，目前仍旧是一个空白，这一研究具有非常重大的意义。

要解决的技术问题关键在于选择合适的α-氨基作为修饰剂，并且在不改变蛋白或多肽抗原溶解性的前提下使其与蛋白或多肽抗原定向地连接，并在此基础上建立其连接率的测定方法体系。

发明内容：

本发明的一个目的是针对目前技术的不足，提供一种蛋白或多肽抗原的修饰方法。

本发明另一个目的是提供所述经修饰的蛋白或多肽抗原的应用。

本发明提供了一种修饰疫苗。

本发明的技术方案是提供一种蛋白或多肽抗原的修饰方法，采用1-甲基色氨酸作为修饰剂，保护氨基后，在缩合剂的作用下与蛋白或多肽抗原缩合反应，再脱去保护基，得到被修饰蛋白或多肽抗原，并测定1-甲基色氨酸与被修饰蛋白或多肽抗原的连接率，以及定性判断被修饰后蛋白或多肽抗原的溶解性。

所述的修饰方法包括以下步骤：

(1)FMOC法实现1-甲基色氨酸的氨基端的保护；

(2)1-甲基色氨酸羧基的活化及在缩合剂DIC和HOBT的作用下与蛋白或多肽抗原的缩合；

(3)步骤(2)反应产物的脱保护；

(4)测定保护基FMOC的浓度以确定1-MT与被修饰蛋白或多肽抗原的连接率，由SDS-PAGE聚丙酰胺蛋白电泳检测被修饰后蛋白或多肽抗原并定性判断产物的溶解性。

步骤(2)1-甲基色氨酸羧基的活化是通过活化剂与1-甲基色氨酸反应使其羧基转化为活泼的酸酐，活化剂选用1-羟基苯并三唑HOBT、N，N-2异丙基碳二亚胺DIC，缩合反应时间为10-20小时，优选12小时。

将步骤(2)反应产物经12000rmp，时间为5min的离心操作得到底层固体，称重后加入到含体积百分比浓度为20％哌啶的DMF溶液中搅拌20min，再经12000rmp，时间为5min的离心操作得到经修饰的蛋白或多肽抗原。