[发明专利]一种利用线粒体DNA D－loop控制区进行鱼类遗传信息分析的方法

说明书

技术领域

本发明涉及鱼类遗传信息分析技术领域，具体的说，涉及一种利用线粒体DNA D-loop控制区进行鱼类遗传信息分析的方法。

背景技术

鱼类线粒体DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)同其他脊椎动物的mtDNA一样，呈共价闭合环状，包括一条重链，一条轻链，是细胞核外具自主复制、转录和翻译能力的遗传因子。与核DNA相比，鱼类mtDNA具有分子小、结构简单、进化速度快、不同区域进化速度存在差异等特点，是一个相对独立的复制单位。鱼类mtDNA的这些特点，使其成为鱼类进化遗传学、分子生态学、遗传多样性及其保护生物学等研究的重要标记。

鱼类mtDNA的结构和基因成分都与其他脊椎动物的类似，均由22个tRNAs基因、2个rRNA基因(12S rRNA和16S rRNA)、控制区(D-环区)、轻链复制起始区和13个疏水性蛋白质多肽组成。位于编码脯氨酸(Pro)和苯丙氨酸(Phe)tRNA基因之间的区域是mtDNA上主要的非编码区，又称为控制区(control region)或D-loop区，是整个mtDNA序列和长度变异最大的区域，但其中也包含有保守片段。控制区是mtDNA变化最复杂，被了解最少，也最吸引人的区域，对控制区结构功能的研究将有助于了解DNA的复制、转录的机制和进化的规律。一般认为，D-loop区是线粒体基因组上进化最快的部分，它的变异速率约为mtDNA完整分子或mtDNA分子上其它区域的5～10倍，是进行鱼类群体遗传结构揭示、濒危物种的遗传多样性程度鉴定等研究方面的重要遗传标记。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种利用线粒体DNA D-loop控制区进行鱼类遗传信息分析的方法。

本发明的利用线粒体DNA D-loop控制区进行鱼类遗传信息分析的方法，包括以下步骤：

(1)分别提取鱼类基因组DNA和线粒体DNA；

(2)在鱼类线粒体DNA D-loop控制区设计简并引物：其上游引物MitDl-F有21个碱基：CAC CCY TRR CTC CCA AAG CYA；下游引物MitDl-R有23个碱基：GGT GCG GRKACTTGC ATG TRT AA；

(3)在引物的作用下进行PCR反应；

(4)琼脂糖凝胶电泳；

(5)对扩增的mtDNA D-loop基因片断进行测序。

在上述方法中，所述鱼类基因组DNA的提取方法优选酚-氯仿法、细胞裂解法或Omega试剂盒法。

酚-氯仿法：取0.1g样品，加入PBS冰浴匀浆。加10％SDS 50μl和蛋白酶K(20mg/ml)，颠倒混匀，55℃水浴2～3h或过夜。加等体积PIC(酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1)至上述样品处理液中，温和、充分混匀。8000rpm室温离心10min，收集上清，反复抽提2～3次，直至水相澄清。加1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。最大转数离心10min，弃上清液。沉淀用70％乙醇(预冷的)洗涤，最大转数离心3min，弃上清液。重复一次。室温下或超净工作台挥发乙醇，待沉淀将近透明后加30～50μl TE溶解，分装后保存。

细胞裂解法：取100mg左右的鱼肌肉，加TEN9细胞裂解液(50mmol·L^-1 Tris·HCl pH9.0，100mmol·L^-1EDTA，200mmol·L^-1NaCl)，终浓度为2％SDS和终浓度为1mg·mL^-1 Protein K，混匀后，56℃消化过夜，经饱和酚，酚-氯仿(酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1)，氯仿(氯仿∶异戊醇＝24∶1)抽提，2倍体积无水乙醇和1/10体积NaAc沉淀，70％乙醇洗涤后，用灭菌蒸馏水溶解，4℃存放。

Omega试剂盒法：取30mg组织剪碎放入有Buffer TL溶液的管中，加入OB蛋白酶旋涡震荡充分混合，在55℃水浴以有效裂解。10000g离心5分钟，小心吸取上清转到无菌的微型离心管中，加入Buffer BL旋涡震荡混合。70℃孵育10分钟。加入无水乙醇完全混合，转入HiBand DNA柱中，8000g离心1分钟。然后用Buffer HB洗涤，8000g离心1分钟。用DNA Wash Buffer洗涤，8000g离心1分钟。重复用DNA Wash Buffer洗涤并离心。加入洗脱液，在室温静置3分钟，10000g离心1分钟以洗脱DNA。