[发明专利]治疗性HBV DNA疫苗、制备方法及应用

说明书

发明领域

本发明涉及一类新型治疗性疫苗的构建、制备及应用。具体的说，本发明涉及治疗性HBV DNA疫苗的构建、制备及应用。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)的持续感染呈全球范围广泛流行。HBV感染可引起急、慢性肝炎和重型肝炎，并与肝硬化、肝癌的发病密切相关，是严重危害人类健康的感染性疾病。目前全球约有3.5亿慢性乙型肝炎病毒感染者，其中75％分布在亚太地区，我国的慢性无症状感染者超过1.2亿，且慢性乙型肝炎预后不良。目前的抗病毒药物主要是核苷类似物和重组干扰素类药物，但效果不十分理想。因此，急需一种更有效的治疗性疫苗，不仅能够预防HBV的感染，而且能够打破慢性乙肝患者的免疫耐受状态，使其产生体液免疫和细胞免疫，清除肝细胞的病毒，使患者痊愈。

DNA疫苗是20世纪末开发出来的新型疫苗，1990年Wolff等发现DNA免疫后，标志着新的疫苗革命。DNA疫苗与传统疫苗相比有诸多优点，尤其是其可诱导特异性CTL反应的能力，使它在抗细胞内感染中独具优势。它将编码外源性抗原蛋白的基因表达载体直接导入机体，通过宿主细胞摄取外源DNA，进入核内进行转录，然后在胞质中翻译，翻译产物进一步与MHC-1类分子结合，提呈至细胞表面，被CD8+T细胞识别，产生较强的CTL的细胞免疫。同时，有一部分短肽可进入溶酶体/内体与MHC-II类分子结合，被CD4+T细胞识别，产生CD4+T细胞介导体液免疫应答。CD4+T细胞介导的免疫应答偏向ThI，产生高水平的IFN-γ，并刺激产生IgG2同种型抗体。这种HBV DNA疫苗在宿主体内表达的抗原的免疫过程与自然免疫相似，可以提呈天然构象的乙肝表面抗原HBsAg，无抗原表位的改变，并且具有长期记忆免疫反应，不但能用于预防，且可用于治疗。因此，乙肝HBV DNA疫苗已经成为当前研究的热点。1993年Davis等开展了HBV基因免疫的研究，但由于安全性、耐受性及有效性等顾虑而仅限于动物实验。1999年Tacket等率先报道HBV DNA疫苗I期临床试验获得较好的结果，标志着HBV

DNA疫苗已从实验研究逐步走向临床应用。2004年法国巴斯德研究所报道的HBV DNA疫苗的I期临床试验取得较好结果，同年，英国和赞比亚的报道临床42例患者耐受性良好。2006年韩国Dong-A药厂的多联疫苗亦取得较好的临床试验结果。

虽然DNA疫苗的初步临床试验结果令人鼓舞，但其免疫效果远未达到理想水平，因此如何增强免疫效果已成为DNA疫苗研究的关键，增强的途径有提高细胞转染率，增加抗原表达及提高机体对抗原的免疫反应性等。其中细胞因子表达质粒作为基因佐剂，克服了细胞因子基因工程蛋白的半衰期短、价格昂贵和毒副作用大等缺点，可显著增强DNA疫苗的免疫效果，而且由于其作用短暂，不会导致全身细胞因子水平增高，不会改变机体对不相关抗原的免疫反应，亦不会促进或诱导病理性自身抗体产生，因此安全性良好。基因免疫最常用的途径是经肌肉或皮肤，其他途径如腹腔、口腔、直肠及阴道，基因枪和肌肉注射是公认的DNA免疫有效导入方式。在HBV DNA疫苗的临床实验中，采用基因枪将包被质粒DNA的金颗粒轰击至皮内，能使有效的抗原提呈和识别相结合，但基因枪接种存在诸如免疫应答持续时间短、金颗粒制备繁琐及随温度增加包被的DNA会脱落等缺点。目前构建DNA疫苗通常包括选取表达抗原的目的基因和细菌质粒真核表达载体。在构建临床应用的质粒时，选用pWRG7077类似的载体，关键的启动子和调控元件为HCMV早期启动子/SV40早期启动子、外显子1、内含子A，加牛生长激素polyA尾(BGH pA)，插入抗生素抗性基因，如氨苄青霉素、卡那霉素，也有选择新霉素或潮霉素的抗性基因，还含pUCori的ColEI或pMB1复制起点便于在大肠杆菌复制。为了防止DNA在宿主细胞中复制并整合到染色体中去，载体中不能含有SV40等病毒复制基因，由于人类对青霉素的过敏反应要比卡那霉素频繁，因而用于临床的DNA疫苗载体最好只选择卡那抗性基因，尽管它比氨苄青霉素抗性基因含有的CpG核苷酸序列要少，(CpG核苷酸序列有显著增强免疫作用，有佐剂效果)。经过改构的pVAX1真核表达载体符合以上特点，而且含有增强目的基因表达的KOZAK序列，是美国FDA批准的唯一可用于临床试验的DNA疫苗载体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用基因重组技术构建的HBV双质粒DNA疫苗，包括疫苗质粒pS2.S和其佐剂质粒pIIF。

本发明的另一目的在于提供一种HBV双质粒DNA疫苗的制备方法。