[发明专利]重组PAC1受体激动剂RMMAX及其表达方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体的说，涉及重组PAC1受体激动剂RMMAX及其表达方法与应用。

背景技术

PAC1受体是垂体腺苷酸环化酶激活多肽(pituitary adenylatecyclase activating polypeptide，PACAP)的特定受体，参与介导PACAP的多种生物学功能。PACAP是1989年发现的，由脑垂体分泌的或目的组织自分泌和旁分泌的具有重要生物学功能的神经多肽，属于是促胰液素/高血糖素/VIP家族中的新成员。PACAP的具有3个受体：PAC1是PACAP的特异受体；VPAC1和VPAC2是PACAP和血管活性肠肽(VIP)的共同受体；PACAP对3个受体具有相同的激动功能。其中PAC1受体主要分布于中枢神经系统、周围神经系统以及睾丸、卵巢、呼吸道、肺、胰腺等非神经组织内等。目前已证实由PAC1介导的PACAP生物学功能有：神经递质/调质、保护神经细胞；神经损伤修复(眼角膜敏感度恢复，眼部手术后神经细胞突出形成)；调节血管；促进激素分泌，调节内分泌平衡；调节性腺功能和生殖细胞的产生；参与消化活动，调节能量代谢平衡；参与调节免疫系统；调节细胞增殖分化；与摄食睡眠有关；与学习和记忆有关；与某些心理感受有；与动物的生物钟有关；等等。

鉴于PAC1介导了PACAP的多种生物学功能，因此开发PAC1的特异激动剂和特异结抗剂具有巨大的药用开发的价值。例如PAC1受体在眼部三叉神经特异高表达，而RMMAX通过PAC1有效促进角膜手术后角膜敏感性的恢复及眼部三叉神经细胞突起的形成(神经产生)；因此在眼睛角膜修复、神经修复及保护方面具有极大的应用价值。

目前已发现的PAC1特异激动剂maxadilan是从白蛉唾液腺中分离的由61个氨基酸组成的多肽，本专利公开的RMMAX，由73个氨基酸组成，与maxadilan有80％同源性，但是是通过基因工程方法制备获得的重组多肽；而且RMMAX与maxadilan相比具有不同的N端和C端序列及修饰，赋予RMMAX更高的稳定性和活性。RMMAX与PACAP基本没有同源性，但能有效激活PACAP的特异受体PAC1，发挥相应的生物学功能。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种具有高稳定性和高活性的PAC1受体激动剂RMMAX。

本发明的另一个目的是提供上述重组PAC1受体激动剂RMMAX的表达方法。

本发明的进一步目的是提供上述重组PAC1受体激动剂RMMAX的应用。

根据RMMAX的氨基酸序列，设计在原核表达的基因，采用基因工程的原理和技术，结合蛋白内含肽(intein)的可诱导剪切功能实现两条目的多肽的高效制备，具体包括如下步骤：

(1)设计并合成RMMAX基因，如SEQ ID NO：1所示。

采用6条引物三步法合成RMMAX基因：引物F3和F4进行链延伸反应；然后以其产物为模板，以F2和F5为引物，进行第一轮PCR；最后以此PCR产物为模板，以F1和F6为引物，进行第二轮PCR，获得RMMAX基因；所述引物F1-6的核苷酸序列如下所示：

F1：CAG GCG CAT CAT AGC AAC GTG CTG CAG ACC AGC GTGCAG ACC ACC GCG

ACC TTT ACC

F2：CGG CAG CTG GCT GGT ATC CAT GCT GGT AAA GGT CGC GGT GGT CTG

F3：TGC CAG TTT CGT AAA GCG ATT GAT GAT TGC CAG AAA CAG GCG CAT CAT AGC

AAC GTG

F4：TTT CTG TTT CAT GCA TTC TTT AAA CAC GCT GTT GCC CGG CAG CTG GCT GGT

ATC CAT

F5：GGTGGTGTCAT ATG GGC AGC ATT CTG TGC GAT GCG ACC TGC CAG TTT CGT

AAA GCG ATT

F6：GGTGGTT CTC GAG TTT GCC CGC TTT AAA TTC TTT TTT TTT CTG TTT CAT

GCA TTC TTT