[发明专利]HLA－B27基因分型用微阵列芯片的制备及其用法

说明书

所属技术领域 

本发明涉及一种临床检测用途的基因检测试剂盒，尤其是涉及DNA微阵列芯片，该试剂盒能够高通量、高效率、高特异性对人类白细胞抗原B27基因进行分型。 

技术背景 

HLA(Human leukocyte antigen，人类白细胞抗原)是人类主要组织相容性系统。组织相容性是指不同个体间进行组织或器官移植时，供者和受者双方接受的程度。供受者组织不相容引起的反应，被证实是一种免疫反应，它是由细胞表面同种异型抗原诱导的，这个代表个体特异性的抗原称移植抗原或组织相容性抗原，其中起主要作用的抗原称主要组织相容性系统(MHS)，HLA(人类白细胞抗原)就是人类的主要组织相容性系统。HLA基因复合体位于人类第6号染色体6p21.3区域，具有高度单核苷酸多态性(SNPs)。HLA存在多个基因座位，每个基因座位有可以分为多种型别、亚型和等位基因。 

HLA的生物学和医学意义包括免疫学反应、器官移植排除反应和疾病关联性等等。在疾病关联性方面，1972年Russel第一个报告银屑病(牛皮癣)患者携带HLA-B13或HLA-B17。此后陆续发现大量其它疾病与特定的HLA相关，其中，HLA-B27抗原见于大约90％的强直性脊椎炎病人，以至使HLA分型具有了诊断价值，甚至，能较早地证实疾病亚型之间的临床区别。例如，寻常银屑病与HLA相关，而脓疱性银屑病则不然；青少年性胰岛素依赖型糖尿病与HLA-B8、HLA-Bw15和HLA-B18相关，而晚期发作型糖尿病并无这种相关；常染色体隐性遗传的肾上腺皮质增生症是由于21-羟化酶缺乏。应用HLA抗原多态性作群体关联分析和家系连锁分析，发现有两个羟化酶位点(21-OHA和21-OHB)与HLA-B、DR紧密连锁，依此，可用HLA作出产前诊断。在优生学中，可以根据现有资料，对某些疾病推算出孩子患病的相对风险率。另一方面，关于HLA与长寿的关系，亦形成一个研究热点。因此，特定类型的HLA便成为某些疾病的遗传标志。HLA-DR4与风湿性和类风湿性炎症的关联性研究进展很快，目前已经受到医学界广泛关注，并开始将HLA-DR4检测用于临床辅助诊断。 

HLA-B27基因型别属于HLA-B基因座位的一个大型，即HLA-B*27型。在HLA-B*27大型中，又可以分为2701-2727众多的亚型和等位基因型。 

强直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis简称AS)又名类风湿脊柱炎。现代医学认为该病是一种慢性、进行性和炎性疾病，病变部位主要在骶髂关节、脊柱、脊柱旁软组织及四肢关 节。病变常自骶髂关节开始，逐渐向上蔓延到脊柱及脊旁组织，最后引起骨性强直。强直性脊柱炎是一种病废率相当高的一种疾病，晚期强直性脊柱炎病情不能逆转，不但使病人失去就业和工作能力，对家庭和社会来说也是一个沉重的负担。但按照现行的诊断标准，一旦确诊为强直性脊柱炎，其病程均已进入晚期。因此，早期诊断已成为当务之急。 

强直性脊柱炎的病因尚未完全明确。但是该病与人类白细胞抗原B27(HLA-B27)的关系非常密切。在强直性脊柱炎患者中发生率可高达90％以上，而在普通人中仅有3％为阳性。HLA-B27阳性携带者患强直性脊柱炎的相对风险为87.4：1。中国人HLA-B27阳性比例约为3％，AS患病率约为0.2％，提示存在HLA-B27以外的遗传因素或外因与AS患病有关。最近研究表明，HLA-B27存在许多基因亚型，目前发现的至少有27种，各种基因亚型在各民族人群中分布比例不同。与AS患病密切相关也仅仅是数个HLA-B27基因亚型，大部分HLA-B27基因亚型与AS患病无关。这项研究发现揭示了，当前HLA-B27阳性率和AS患病率间巨大差距的原因，以及各民族间AS患病率差异性原因。Cipriani等对Zulian人群HLA-B27基因亚型研究发现，AS患病者主要是B2705(68.8％)和B2702(31.2％)，正常人群HLA-B27基因亚型主要是B2708。Sampaio-Barros等对比利时AS患者研究发现，HLA-B2705是主要携带分子，占92.5％，B2706、B2707与AS发病无关。台湾本土的强直性脊柱炎患者，HLA-B27阳性比率高达95％，而其中2704亚型占了绝大多数(89％)，另外少数为2705型(11％)。 

近10年，HLA-B27的四联结构常被误认为是唯一可能的致病结构，并成为许多研究的基础。HLA-B27介导关节炎不仅通过其HLA-I类分子结构，还与其轻链和游离重链的形式多为二聚体结构有关。HLA-B27各亚型间有1～7个氨基酸的区别，各亚型与AS相关的程度的研究结果如下：