[发明专利]一种镉螯合物单克隆抗体及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种镉螯合物单克隆抗体，其特征在于该抗体对镉-1-(4-异硫氰酸苄基)-乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白和镉金属螯合物具有特异性。

2.根据权利要求1镉螯合物单克隆抗体，其特征在于所述抗体与镉-1-(4-异硫氰酸苄基)-乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白偶联物的反应的OD450值为1.527-1.562，与镉-1-(4-异硫氰酸苄基)-乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白反应的OD450值为0.001-0.029，与BSA反应的OD450值为0-0.001；对Cd-EDTA的交叉反应性为100％，对Pb-EDTA、Zn-EDTA、Hg-EDTA、Mn-EDTA、Cu-EDTA、EDTA的交叉反应性均＜0.05。

3.一种镉螯合物单克隆抗体的制备方法，其特征在于该方法包括下述步骤：

(1)镉-1-(4-异硫氰酸苄基)-乙二胺四乙酸-钥孔戚血蓝素免疫小鼠；

(2)免疫小鼠脾细胞与SP20骨髓瘤细胞的融合及培养；

(3)镉-1-(4-异硫氰酸苄基)-乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白和1-(4-异硫氰酸苄基)-乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白包被酶标板，筛选阳性克隆的杂交瘤细胞；

(4)竞争抑制进一步筛选阳性克隆的杂交瘤细胞；

(5)阳性克隆的杂交瘤细胞移植降植烷处理的BALB/c小鼠制备单克隆抗体。

4.根据权利要求3所述一种镉螯合物单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述步骤(1)的镉-1-(4-异硫氰酸苄基)-乙二胺四乙酸-钥孔戚血蓝素的制备包括下述步骤：

A、将牛血清白蛋白、钥孔戚血蓝素分别溶于pH9.5的磷酸盐缓冲液，浓度为4～6mg/mL；

B、将10mg螯合剂1-(4-异硫氰酸苄基)-乙二胺四乙酸溶于0.1mol/L，pH9.5的磷酸钠缓冲溶液，浓度为18～22mg/mL；

C、按照1∶1的摩尔比，将螯合剂和Cd²⁺溶液混合，用氨水调节pH至7.0～8.0，在20～30℃下搅拌反应12～36小时，合成半抗原；

D、取2～4mg的半抗原分别与步骤A等质量的牛血清白蛋白和钥孔戚血蓝素混合，分别用氨水调节pH至8.5～9.5，在20～30℃下搅拌反应12～36小时，分别合成免疫原和包被抗原；

E、用超纯水代替Cd²⁺，重复步骤C、D，合成无金属的包被抗原1-(4-异硫氰酸苄基)-乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白；

F、用Centeicon-30超滤离心管纯化合成后的抗原，用0.1mol/L，pH9.0 HEPES和0.1mol/L，pH7.4 HEPES溶液作为缓冲液进行离心洗脱，分装、冻干后，-70℃冻存。

5.根据权利要求1所述一种镉螯合物单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述步骤(2)免疫小鼠脾细胞与SP20骨髓瘤细胞的融合及培养是指免疫小鼠脾细胞与SP20骨髓瘤细胞以2～5∶1混合，1分钟内加入50％聚乙二醇融合，90秒之内加入30～40ml的1640培养液，静置10分钟，离心，细胞用含HAT和小鼠腹腔巨噬细胞的含血清1640培养液重悬后加入96孔培养板孔，置CO2培养箱中37℃培养，5天后用含HAT的1640完全培养液换液培养，10天后用含HT的1640完全培养液换液培养，以后改为1640完全培养液培养。

6.利用镉螯合物单克隆抗体检测镉离子的浓度的方法，其特征在于，以镉螯合物单克隆抗体1-OD₄₅₀的OD值为横坐标X，镉离子的浓度为纵坐标Y，建立检测的标准曲线，线性方程为：Y＝0.0081X+0.1115，线性相关系数R²＝0.9922；其中，OD₄₅₀是通过单克隆抗体特异性鉴定方法得到。

7.根据权利要求6所述利用镉螯合物单克隆抗体检测镉离子的浓度的方法，所述单克隆抗体特异性鉴定方法包括如下步骤：

(1)包被抗原Cd-ITCBE-BSA，100μL/孔，4℃吸附过夜，洗板3次；

(2)加入100μL1％BSA封闭，37℃温育1h，洗板3次；

(3)加入100μL金属螯合物或EDTA稀释液和100μL单克隆抗体稀释液(1∶4000)，37℃，2h，洗板3次；加入1∶2000稀释的酶标二抗或羊抗鼠IgG-HRP，37℃温育45min，洗板3次，加底物反应，30min后终止反应，检测OD₄₅₀。