[发明专利]链亲和素－白细胞介素2融合蛋白

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程和蛋白质工程领域，具体涉及来源于动物的多肽，特别是白细胞介素-2。

背景技术

白细胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)是一种T细胞生长因子和信号调节分子，有很重要的免疫调节作用。有如下功能：促进T细胞增殖，提高细胞毒T细胞、NK细胞和单核细胞活性；诱导B细胞生长和抗体产生；诱导周围血中淋巴细胞衍生为LAK细胞；诱导继发的细胞因子分泌，如TNFαt、GM-CSF、IFN等；增强T细胞表面的IL-2受体的表达。因此，IL-2具有抗病毒、抗肿瘤和增强机体免疫功能等作用。IL-2基因常用来修饰肿瘤细胞，制备肿瘤细胞疫苗，以增强肿瘤抗原的免疫原性。通过原位基因转染(或转导)在肿瘤病灶局部实现IL-2持续有效表达的治疗策略，已在表浅膀胱癌的临床前研究中显示出诱人的前景。但是，用基因修饰法制备肿瘤细胞疫苗存在如下固有缺陷：修饰效率一般都较低(尤其是原位基因转染或转导)，并取决于肿瘤细胞类型；因影响因素较多，致使治疗基因的蛋白质表达产物的有效浓度在局部难于达到并较长时间地维持，从而实际抗肿瘤的临床效果非常有限；因个体差异和获得肿瘤标本时肿瘤细胞的成活状态不一致，往往有些病人因无法提供成活状态较好的肿瘤细胞，最终不能制成自体肿瘤细胞疫苗；往往有潜在的病毒载体安全性问题(所谓“遗传毒性”)和免疫原性问题(反复使用同一病毒载体会影响导入基因的表达效率)；很难同时高效表达多个具有协同作用的免疫刺激因子，并对它们的表达量进行精确控制。此外，基因修饰的自体肿瘤细胞疫苗制备比较费时，不易大规模开展和广泛使用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种可以对肿瘤细胞进行快速表面修饰并能够永久地锚定在肿瘤细胞表面的新型白细胞介素-2。

本发明解决上述技术问题的技术方案是：

一种融合蛋白，该蛋白由接头肽连接一链亲和素和一白细胞介素-2构成，其中所述的接头肽的氨基酸序列为Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser。

本发明融合蛋白中的链亲和素位于接头肽的N端或C端；其中链亲和素位于接头肽的N端的融合蛋白(如SEQ NO.2)的活性比链亲和素位于接头肽的C端的融合蛋白(如SEQ NO.1)高两倍以上。

本发明融合蛋白可通过将链亲和素基因、白细胞介素-2基因以及连接所述的链亲和素和白细胞介素-2的接头多核苷酸通过基因重组、转化构建工程菌表达获得，其中基因重组和转化的方法均为本领域普通技术人员所熟识的技术。

为了便于融合蛋白的分离纯化，本发明所述的融合蛋白的链亲和素部分的末端还可以连接有纯化标签，如本发明融合蛋白SEQ NO.3的链亲和素的C端连有组氨酸标签、本发明融合蛋白SEQ NO.4的链亲和素的N端连有组氨酸标签。

本发明还提供一种编码本发明融合蛋白的多核苷酸，该多核苷酸由成熟链亲和素cDNA、成熟白细胞介素-2 cDNA通过TCG AGC GGG GGC AGC GGG GGC GGA GGC AGC GGCGGG GGC GGATCC连接而成；该多核苷酸中成熟链亲和素cDNA的末端还可以连接有CATCATCAC CATCAC CAT。

将所述的编码本发明融合蛋白的多核苷酸通过基因重组插入到原核表达载体中，然后转化大肠杆菌可获得高效表达本发明融合蛋白的工程菌；所述的原核表达载体可以是pET24a或pET24d，大肠杆菌为BL21(DE3)。

本发明融合蛋白在上述工程菌中主要以包涵体的形式存在，从包涵体中分离纯化蛋白并复性处理后，即可获得本发明融合蛋白。

本发明融合蛋白采用富含甘氨酸和丝氨酸的链接肽连接白细胞介素-2和链亲和素，此15肽非常灵活，有助于融合蛋白中各单元蛋白质分子的独立折叠，从而保存各自的生物活性，使融合蛋白具有链亲和素和白细胞介素-2的双重活性，可通过链亲和素与生物素的强力结合将白细胞介素-2锚定在生物素化的肿瘤细胞表面，且能在γ射线灭活肿瘤细胞表面稳定存在，并仍保持白细胞介素-2的活性。

经本发明融合蛋白表面修饰的肿瘤疫苗具有预防和治疗肿瘤的作用，可用于制备预防性和治疗性肿瘤的疫苗。本发明所述的肿瘤疫苗是将本发明融合蛋白锚定在生物素化的肿瘤细胞表面获得的。