[发明专利]志贺氏菌检测用引物、检测方法、检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)技术的食源性病原体快速检测技术。特别涉及对志贺氏菌特定基因片段具有特异性的引物及引物组；还涉及将所述引物及引物组用环介导等温扩增法检测志贺氏菌的检测方法和检测试剂盒。

背景技术

食源性疾病发病率较高，由沙门氏菌，志贺氏菌，金黄色葡萄球菌，变形杆菌，霍乱弧菌，副溶血性弧菌以及E.coli O157:H7，轮状病毒以及诺如病毒引起的食物中毒，其发病率在我国食源性疾病发病率中占非常高的比例，是一个严重的公共卫生问题。

目前对食源性病原体的检测主要依靠病原体分离法、免疫学方法和各种PCR方法。病原体分离虽然是金标准，但繁琐费时，一般需要5天时间，最长需要一个月时间，而且免疫学方法的特异性和敏感性均较低。

随着分子生物学技术的发展，人们采用PCR技术应用于细菌的诊断。例如PCR中国专利公开号CN1526825的专利申请，批露了一种利用副溶血性弧菌PR72H序列的特异性，通过DNA提取、PCR扩增、电泳观察等分子生物学手段检测副溶血性弧菌的方法。虽然该方法敏感、准确、快速，但由于需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技术要求而使其不适用于现场快速检测及基层普及应用。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术(国际专利公开号WO 00/28082)是2000年Notomi等开发出一种核酸扩增新技术，即针对靶基因的6个区域设计4条特异引物(如有需要还可以添加有环引物对)，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在65℃左右恒温条件保温约60分钟，即可完成核酸扩增反应，扩增结果可直接对扩增副产物焦磷酸镁沉淀通过肉眼进行判断或者对其浊度进行检测，也可用结合双链DNA的荧光染料SYBR Green I染色，通过肉眼进行判定。用于LAMP技术扩增的2对引物乃针对基因6个区段，因而具有比PCR更高的特异性，同时也具备不需要热循环、其单位时间内扩增效率更高、且不需特殊仪器等优点。但是目前未有利用环介导等温扩增法检测志贺氏菌的检测方法和检测试剂盒。

发明内容

本发明的一个目的在于，提供一种对志贺氏菌特定基因片段具有特异性的引物。

上述目的是通过如下技术方案实现的：

一种志贺氏菌检测用引物，其特征在于，能扩增靶基因的特异碱基序列，所述靶基因为志贺氏菌的ipaH---GenBank登陆号：M32063，所述引物与所述靶基因的1095---1299bp位的核酸序列的一部分或其互补链互补。

本发明的另一个目的在于，提供一种对志贺氏菌特定基因片段具有特异性的引物组。

上述目的是通过如下技术方案实现的：

一种志贺氏菌检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成：

正向外引物F3-ipa    ATACCGTCTCTGCACGCA

反向外引物B3-ipa    TCGAAAAGGCCTTCTGATGC

正向内引物FIP-ipa GCGAAAGACTGCTGTCGAAGCTTTCCGTGAACAGGTCGCT

反向内引物BIP-ipa TGCCACTGAGAGCTGTGAGGACTGATGGACCAGGAGGGTT

可以扩增志贺氏菌的ipaH(M32063)基因序列的1095---1299bp位的核酸序列的一部分或其互补链。

特别地，为了加快扩增反应速度，所述引物组还可以包括：

正向环引物LF-ipa GGCACTGAGTTTTTCCAGCCAT

反向环引物LB-ipa  CGCTCACATGGAACAATCTCCGG

本发明的另一个目的在于，提供一种利用上述引物或引物组基于环介导等温扩增法检测志贺氏菌的检测方法。

上述目的是通过如下技术方案实现的：

一种志贺氏菌的检测方法，该方法用于检测标本中是否存在志贺氏菌，其特征在于，以志贺氏菌的ipaH(M32063)基因序列的1095---1299bp位的核酸序列的一部分或其互补链为靶，通过LAMP法用上述引物或引物组选择性扩增上述靶区域，确认是否存在有扩增产物。

具体检测方法为：