[发明专利]一种快速检测石斑鱼虹彩病毒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及石斑鱼虹彩病毒检测技术领域，具体的说，涉及一种快速检测石斑鱼虹彩病毒的方法。

背景技术

2000年后，日本出现一种全新的核酸扩增技术——环介导的核酸等温扩增LAMP(loop-mediated isothermal amplification)技术。LAMP是一种敏感的链取代核酸扩增技术，这种方法能在恒温条件下(约65℃)、一个小时内，将目的DNA从几个拷贝扩增到10⁹个拷贝(Tsugunori Notomi等，2000)。LAMP技术扩增、检测目的核酸片断，一般以200～300bp为宜，一般实验流程包括：GeneBank检索目的基因片断(并通过BLAST确定该片断与其他物种基因的同源性)，人工或在线设计引物组，引物合成、Bst DNA polymerase large fragment(若进行RT-LAMP扩增，还需加入AMV或ALV反转录酶)及相关缓冲液准备，确定反应体系、扩增，反应结果判定等。

1.LAMP扩增的原理：

LAMP扩增主要利用了Bst DNA聚合酶大片段的两大特性：一是DNA聚合酶具有5′→3′DNA聚合酶活性，能在恒温状态下扩增DNA核酸；二是Bst DNA聚合酶不具有5′→3′外切核酸酶活性，能将新合成的核酸单链从新生成的DNA双链上置换(取代)下来，形成两条独立的核酸单链以开启下一轮的DNA核酸合成；进而免去了每次扩增前的DNA变性环节。在此基础上，巧妙地设计能识别6个(或8个)独立DNA序列的LAMP引物组(4引物组或6引物组)，使得Bst DNA聚合酶的两大特性充分发挥。其中，内引物(BIP、FIP)的设计是LAMP引物设计的亮点、难点。

Bst DNA聚合酶大片段是Bacillus stearothermophilus DNA聚合酶的一部分，来源于E.coli菌株，此菌株含有来自Bacillus stearothermophilus DNA聚合酶的基因，该基因不具有5′→3′外切核酸酶活性。应用基因重组技术，将麦芽糖结合蛋白(MBP)基因与该基因融合表达，纯化后再去除麦芽糖结合蛋白。

第一阶段：扩增始发物形成

1步：当双链DNA处于65℃左右的动态平衡中时，引物组中的BIP引物就能通过互补结合到目标DNA双链上，在Bst DNA聚合酶作用下，启动DNA合成。

2步：从BIP的B2区域3’端开始合成DNA模板的互补链至F3C；

3步：B3引物退火结合到模板DNA的互补区域B3C，启动链取代合成，同时释放由BIP引物引导合成的互补链。

4步：释放的DNA的B1C区域结合B1区域，形成茎环结构；1.3步释放的DNA链作为FIP引物以及F3引物的模板，按BIP端相同的模式启动DNA的合成及链取代，释放的DNA链在FIP端同样形成茎环结构。进而，形成哑铃形结构扩增始发物。

第二阶段：延伸

5步：哑铃结构通过自引导DNA合成迅速转换成茎环结构DNA；

6步：BIP引物与茎环结构的环状单链区域结合并开始新的DNA合成，由于F1及F1C的互补关系，再次形成茎环结构，先前合成的DNA链得以释放；

7步：FIP引物同样与对应的茎环结构的环状单链区域结合，由于B1及B1C的互补关系，再次形成茎环结构，先前合成的DNA链得以释放；

8步：如此周而复始扩增，最终形成不同长度(目的片断长度的自然数倍)花椰菜cauliflower状的反向重复序列(Notomi.T等，2000)。

2.引物设计：

LAMP引物的设计比常规PCR要复杂的多。一个反应至少包括4条引物，包括一对内引物(FIP和BIP，各约40bp)和一对外引物(F3和B3，各约25bp)；如果添加一对环引物(loop primer)，反应便可以加速，反应时间减半，大大增加扩增检测的效率^[2]。Primer Explorer version 3软件可以专门设计各种特异LAMP引物，用户只需按要求提交目的片断序列，设置相关参数，系统便能产生多种引物组合供用户选择。此外，LAMP引物可以人工设计，各引物的组成(请见表1-2)，引物设计的其他技术细节及注意事项可参考相关文献(Tsugunori Notomi等，2000；K.Nagamine等，2002)。

表1.LAMP引物组成