[发明专利]一种嗜碱芽孢杆菌及其产生的内切葡聚糖酶和应用

权利要求书

1.一种嗜碱芽孢杆菌，其特征在于：所述嗜碱芽孢杆菌是产内切葡聚糖酶菌株Bacillus sp.III-3，菌种保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日：2007年8月22日，保藏号：CGMCC No.2138。

2.根据权利要求1所述的-种嗜碱芽孢杆菌，其特征在于：所述嗜碱芽孢杆菌的菌种形态特征：菌落圆形，浅黄色，半透明，革兰氏染色阳性，显微镜下观察个体形态为较细长杆状，次端生芽孢；该嗜碱芽孢杆菌的培养基配方按质量百分比计为：1％复合蛋白胨，0.5％酵母粉，0.5％NaCl，0.1％KH₂PO₄，0.25％Na₂HPO₄·12H₂O，2％CMC-Na，0.5％Na₂CO₃，固体培养基加1.5％的琼脂，培养pH值：7～10，培养温度：30～37℃。

3.权利要求1所述的嗜碱芽孢杆菌产生的碱性内切葡聚糖酶，其特征在于：所述碱性内切葡聚糖酶是按下述方法制得：

(1)菌种液体发酵培养：

将嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.III-3菌种接到50mL液体发酵培养基中，于30～35℃、150r/min条件下培养48h；将48h发酵液以14000r/min的转速冷冻离心20min，上清液加入四倍体积的pH 8.0Tris-HCl缓冲液，即得粗酶液；

(2)碱性内切葡聚糖酶的分离纯化：

(a)离子交换层析

将50mL的粗酶液加到预先用pH8.0 Tris-HCl缓冲液充分平衡的DEAE-Sepharose CL-6B层析柱，依次用含0.4M、0.45M、1M NaCl的pH8.0Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，并收集有酶活的洗脱峰，将此酶活峰收集、合并、透析、浓缩后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；

(b)凝胶过滤层析

将DEAE-Sepharose CL-6B离子交换层析所得的酶活峰透析浓缩，通过Hiload 16/60 Superdex 200 pg预装柱进行凝胶过滤层析；先用两倍柱体积的pH8.0Tris-HCl缓冲液平衡层析柱，待基线稳定后取10mL样品上样，收集凝胶过滤层析的酶活峰并通过透析浓缩，得到碱性内切葡聚糖酶。

4.根据权利要求3所述的碱性内切葡聚糖酶，其特征在于：所述碱性内切葡聚糖酶的MALDI-TOF质谱分析得到质荷比分别为833.4243、848.4665、862.4368、878.4152、931.5079、1062.5212、1194.5828、1319.5923、1335.6595、1386.6362、2953.2993、1919.881的特征峰；所述碱性内切葡聚糖酶蛋白分子量为89kD，等电点为4.3；最适pH为9.0～10.0；最适反应温度为40～50℃；所述酶蛋白耐Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺或Ca²⁺金属离子；所述碱性内切葡聚糖酶置于终浓度为0.1％的洗涤剂中保存10min后其残余酶活可高达到80％以上。