[发明专利]实时荧光定量PCR检测绿脓杆菌的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及检测临床细菌性肺炎、角膜溃疡、泌尿道感染、败血症等患者样品中以及化妆品、环境检测物等样品中的绿脓杆菌(铜绿假单胞菌)存在的试剂盒，特别是涉及以实时荧光定量聚合酶链反应技术早期、快速诊断绿脓杆菌感染的试剂盒。 

背景技术

绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)又称铜绿假单胞菌，属于假单胞菌属，在自然界中广泛存在，是一种常见的条件致病菌，可引起人和动物致病，引起化脓感染，人主要表现在烧伤、外科创伤和手术后感染居多。临床上可引起败血症、呼吸道感染、心内膜炎、尿路感染、中枢神经系统感染、骨关节感染、眼科、耳、乳突及鼻窦感染、皮肤软组织感染、消化道感染等。由于绿脓杆菌分布广、适应性强、且容易产生抗药性，是医院内感染的重要病原菌，常引起医院内感染的爆发和流行，因此，为了监测和控制绿脓杆菌的感染，研究绿脓杆菌的快速检测方法具有重要意义。 

传统的检测方法主要依靠绿脓杆菌的生物学特征(如革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓毒素等)结合多种生化试剂进行检测，虽然该方法具有一定的特异性和敏感性，但操作繁琐且耗时长，不利于对大规模样品进行检测。由于绿脓杆菌感染进展快，易耐药，病死率高，传统的检测方法有可能延误诊断和治疗，因此，开发早期、快速的检测技术非常必要。 

近年来，随着分子诊断技术的飞速发展，聚合酶链反应(PCR)技术已经广泛应用于细菌、病毒基因水平的研究，也给微生物的快速鉴定提供了可能。国内外已经有部分实验室采用PCR扩增靶核酸来检测绿脓杆菌，如：Kingsford通过扩增16S rRNA基因来检测羊毛洗脱液中的绿脓杆菌(Kingsford NM，Raadsma HW.Detection of Pseudomonas aeruginosa from ovine fleecewashings by PCR amplification of 16S ribosomal RNA[J].VeterinaryMicrobiol，1995，47(1-2)：1-70)，Saint以脂蛋白I基因为靶点，通过设计引物和杂交探针来检测绿脓杆菌(Saint O，Romeyer F，Lebel P，et al.Specificity of the Pseudomonas aeruginosa Ollipoprotein I gene as a DNA probe and PCR target region within the Pseudomonadaceae[J].JGeneral Microbiol，1992，138(4)：733-741.)，Song通过扩增外毒素A基因来检测角膜炎患者临床标本中的绿脓杆菌(Song KP，Chan TK，Ji ZL，Wong SW：Rapid identification of Pseudomonas aeruginosa from ocular isolates by PCR using exotoxin A-specific primers.Mol Cell Probes2000；14：199-204.)，由于需要对PCR产物进行电泳或杂交分析等后处理，极易造成PCR产物污染，导致假阳性，不宜用于临床诊断。 

实时荧光PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有核电偶联装置(CCD)的PCR扩增仪，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平。CCD能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，并通过软件分析汇总到工作站得到扩增曲线。TaqMan PCR技术是实时荧光PCR的一种(Mackay IM et al.Real-time PCR in virology.Nucleic Acids Res.2002 5；30(6)：1292-1305；Lie，Y.S.，Petropoulos，C.J.，Advances in quantitative PCR technology：5’nuclease assays.Current Opinion inBiotechnology 1998.9，43-48.)。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出荧光的能量转移给淬灭基团，呈现淬灭效应。如果扩增过程中有靶序列的存在，扩增的过程中探针分子逐渐被水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光共振能量转移效应，荧光报告基团发出荧光信号。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。