[发明专利]唐鱼β－actin基因远端调控序列及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及唐鱼β-actin基因远端调控序列、重组表达载体及应用。

背景技术

转基因鱼的研究作为转基因动物研究领域的一部分，它的诞生是动物基因工程研究最突出的方面，也是目前国内外获得最成功的转基因动物之一。

与哺乳类相比，转基因鱼有其自身的优点，如鱼类产卵量大、胚胎经基因转移操作后不需放回母体内培育，携带的与人类卡相关的病原体较少等，所以通过转基因鱼进行基因表达调控、发育生物学、遗传学、生理学等基础研究具有潜在的经济价值。

因为远源基因存在着在受体鱼细胞中的表达调控与生物学效应以及转基因鱼消费安全等问题，使用同源或亲缘关系较近的鱼类功能基因和调控序列不但具有安全性而且有助于鱼类转基因的有效表达，提高转移基因的表达水平，所以从鱼类基因组DNA中提取功能基因和调控序列在生物工程中有着重要的经济利用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有强启动活性的唐鱼β-actin基因远端调控序列，以提高外源基因在转基因鱼类中的表达水平。

本发明的另一个目的是提供一种含有上述唐鱼β-actin基因远端调控序列的重组表达载体。

本发明的另一个目的是提供一种含有上述唐鱼β-actin基因远端调控序列的重组微生物。

本发明的进一步目的是提供上述唐鱼β-actin基因远端调控序列在转基因鱼类表达调控中的应用。

本发明将唐鱼基因组DNA经内切酶EcoRV消化纯化后与试剂盒GenomeWalker Universal Kit提供的接头连接，RT-PCR扩增得到1800bp的特异带，克隆测序为β-actin 5’侧翼序列；根据此序列及已获得的唐鱼β-actin近端调控序列设计一对引物，以唐鱼基因组DNA为模板，RT-PCR扩增出一条3000bp的特异带，切胶回收后与载体pMD19-T连接转化大肠杆菌(E.coli)DH5α，测序确定为β-actin远端调控序列，命名为TLA，包含1.8kb的5’侧翼序列以及长为1.2kb的β-actin的第一个不翻译的外显子和第一个内含子。重组子命名为TLA-T。

本发明将唐鱼β-actin基因远端调控序列经粘端连接插入红色荧光表达载体pDsRed2-1中，得到重组表达载体，命名为pTLA-DsRed(7.1kb)。

本发明克隆获得的唐鱼β-actin基因远端调控序列具有强的启动活性，其参与构建的重组表达载体经显微注射到唐鱼体内后外源基因可在唐鱼体内高表达。将线性化后的重组荧光表达载体通过显微注射入唐鱼的受精卵中并孵化培育，荧光显微镜下观察荧光，转基因唐鱼仔鱼(孵化出膜72h)的体表可见红色荧光，部分转pTLA-DsRed仔鱼则在解剖镜下就可观察到鱼体背部呈现红色荧光，而转基因唐鱼成鱼在肉眼下则可观察到红色荧光；以已获得的转pTLA-DsRed基因唐鱼和野生型唐鱼的cDNA第一链为模板，对RFP和β-actin基因进行扩增及电泳。AlphaImager^TM图像分析系统的相对半定量分析显示：转基因唐鱼能检测出外源基因RFP的mRNA，且mRNA有较高的表达量，其RFP mRNA的表达量比由唐鱼β-actin近端调控序列启动的转pTA-DsRed基因唐鱼高35.7％。这与用荧光显微镜观察RFP的表达的结果相同，说明3.0kb的唐鱼β-actin基因远端调控序列具有强的启动活性。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1、β-actin是管家基因，也是最主要的非肌肉型或胞质肌动蛋白异型体，从唐鱼基因组DNA中得到β-actin基因远端调控序列，包含有CCAAT框，TATA框、CArG框的上游调控序列以及下游的第一个外显子和第一个内含子，该序列具有有效的驱动基因表达的功能，为下一步进行功能基因的转移打下了基础；2、由该远端调控序列与红色荧光表达载体构建的重组荧光表达载体，转入鱼卵后对成鱼进行检测证实，该重组荧光表达载体能使外源基因在鱼类体内高效表达；3、本实验得到的转荧光基因唐鱼体色红艳，其体色不需要荧光灯的照射白天在室内也同样艳丽，具有较高的观赏性，有很高的经济价值。

附图说明

图1为转基因重组表达载体的详细构建过程；

图2为远端调控序列TLA驱动的RFP基因在唐鱼中的表达；

图3为RFP在转基因唐鱼中表达的半定量分析；

图4为转基因唐鱼中RFP与β-actin mRNA表达量比值。

具体实施方式