[发明专利]香蕉枯萎病菌4号小种的快速检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物保护和生物技术领域，尤其涉及香蕉枯萎病菌4号小种的快速检测方法。

背景技术

香蕉镰刀菌枯萎病又称香蕉巴拿马病、黄叶病，是由镰刀菌侵染引起维管束坏死的土传性病害，病原菌为尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)。病原菌从受伤的根茎侵入，通过寄主维管束向茎上发展，并进一步向叶部蔓延。当植株枯死后，病原菌随残体遗留在土壤中，随着水流或带菌的农具在蕉园内再进行自然传播，其厚垣孢子可在土壤中存活8-10年。由于该菌存活期长，传播迅速，尚未有防治该病的特效药物，因此容易大面积爆发而造成重大损失。

尖孢镰刀菌古巴专化型有4个生理小种，1号小种(FOC1)感染香蕉的栽培种“大蜜哈”[Grosmichel(AAA)]及龙牙蕉(MusaAAB)，矮香蕉[Dwarfcavendish(AAA)]较抗病，该小种呈世界分布，在中国大陆已有记录；2号小种(FOC2)在中美洲，仅感染三倍体杂种梭香蕉[Bluggoe(AAB)]，不侵染“大蜜哈”；3号小种(FOC3)感染野生的羯尾蕉属(Heliconia)；4号小种(FOC4)能感染几乎所有的香蕉种类，如Cevendish、“大蜜哈”、矮香蕉、野蕉(BB)和梭指蕉，毁灭性最大。目前，尚未培育出有效的香蕉抗4号小种品种。

目前，对香蕉枯萎病菌4号小种仍采用传统的生物学和致病性检验检测技术鉴定，需要较长的时间才能区别4号小种和1号小种。即使采用病原菌分离和结合VCG或者Komada改良培养基上的性状来确定4号小种，也需要较长时间，一般需要30天甚至更多的时间鉴定确诊，不利于香蕉枯萎病的及时防控。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种香蕉枯萎病菌4号小种的快速检测方法，利用香蕉枯萎病菌4号小种的引物进行香蕉植株的DNA进行PCR扩增和循环以后进行电泳检测。

本发明的技术方案是提供一种香蕉枯萎病菌4号小种的快速检测方法，包括以下步骤：

(1)抽提香蕉植株的DNA；

(2)电泳检测(1)的模板DNA；

(3)PCR扩增DNA扩增；

(4)PCR循环；

(5)电泳检测。

步骤(2)所述电泳检测模板DNA是取5μL(1)步骤提取的香蕉植株DNA样品与载样缓冲液混合，用1％的琼脂糖凝胶电泳40min，5v/cm，于凝胶成像系统下观察有无DNA条带。所述载样缓冲液为TAKARA公司出品的6×loading buffer。

步骤(3)所述PCR扩增DNA的扩增反应体系如下：

模板DNA                       1μL；

10×PCR Buffer                2.5μL；

Mg²⁺(25mmoL/L)                2.5μL；

dNTPs(25mmoL/L)               2μL；

引物RF4-1(10μmoL/L)          1μL；

引物RF4-2(10μmoL/L)          1μL；

Taq酶(5U/μL)                 0.2μL；

灭菌ddH₂O                     至总体积25μL。

所述引物为：

RF4-1：5’-TGCGGGTCCTATTAGTAC-3’；

RF4-2：5’-GGTCCTCACACTCCAATC-3’。

步骤(4)所述PCR循环为94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min。

步骤(5)所述电泳检测是取出步骤(4)反应混合液5μL与载样缓冲液混合，1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物903bp特异条带。电泳凝胶为：1％的琼脂糖凝胶，配方为：1g琼脂糖，100mL0.5×TBE电泳缓冲液，5μL溴化乙锭(EB)，其中，0.5×TBE电泳缓冲液由5×TBE(54g Tris，27.5g硼酸，20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，定容至1000ml)稀释十倍再使用。

本发明与现有技术相比，其有益效果表现在：

(1)本发明提供了一个快速的检测方法，应用该方法可在6小时之内对香蕉枯萎病菌4号小种进行快速、准确检测。