[发明专利]一种物理场强化金属配位壳聚糖定位酶解方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种壳聚糖酶解方法，特别是一种物理场强化金属配位壳聚糖定位酶解方法。

背景技术

壳聚糖(Chitosan)是天然高分子甲壳素脱乙酰化后的产物，是由β-(1，4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖单元和β-(1，4)-2-乙酰胺基2-脱氧-D-葡萄糖单元组成的共聚体。与其他高分子材料相比，壳聚糖具有可生物降解、无毒性、具有良好生物相容性等特点，近年来在食品、医药、化妆品、化工、环保等方面得到越来越广泛的应用。但是，壳聚糖是高分子化合物，分子量通常很大，并且分子结构紧密，溶解性差，难以被吸收利用，大大限制了其应用。将壳聚糖降解后得到的低聚壳聚糖，水溶性、生理活性都比壳聚糖更为优越。低聚壳聚糖能活化人体淋巴细胞，促进脾脏抗体生成，抑制癌细胞的繁殖和扩散；强化肝脏功能，防止胃溃疡；降低血压、血糖、胆固醇等；具有较强的抗菌作用和显著的保湿能力；有利于人体益生菌生长同时抑制致病菌。当低聚壳聚糖为6～8糖时，生物利用度最好，在抑制肿瘤方面的作用令人鼓舞，是当今国内外研究开发的热点。因此，如何获得窄分子量分布的低聚壳聚糖是提高壳聚糖应用价值的关键。

制备低聚壳聚糖的方法，大致可分为酸降解法、氧化降解法、酶降解法和物理降解法。其中的物理降解法多是用于配合其它方法，强化降解效果。酸水解法价格低廉，操作简单，缺点是反应过程和得到的低聚壳聚糖的分子量分布难以控制，并且对环境污染严重。氧化降解法具有反应速度快、产率高、反应物无毒等优点，但是控制产物分子量分布的效果不理想。酶降解法可在较温和的条件下进行，能选择性地切断壳聚糖的β-(1，4)糖苷键，对降解产物的分子量分布有一定的控制作用，反应过程容易掌控。其中所用的酶可分为专一性酶和非专一性酶。专一性酶不易获得，价格昂贵，难以商业化。在降解壳聚糖的非专一性酶中，蛋白酶作用明显，其降解能力甚至超过了壳聚糖酶和溶菌酶。而且，蛋白酶价格便宜，稳定性好，具有良好的工业化前景，所以日益受到重视。虽然酶降解法与其它方法相比具有较大优势，但对产物的分子量控制作用仍不够理想，不能满足市场的高要求。因此，如何更有效控制低聚壳聚糖分子量分布范围，是提高其应用的关键。

壳聚糖糖元的2位为-NHCOCH₃或游离的-NH₂，3位为仲-OH和6位为伯-OH，可借助氢键和盐键形成类似网状结构的笼形分子，因而壳聚糖对过渡金属及稀土金属离子有极好的配合能力，可制备壳聚糖-金属配合物。近几年，人们对不同的金属离子与壳聚糖配合进行了较为具体的研究，揭示了壳聚糖对金属离子的吸附动力学规律和壳聚糖-金属配合物的结构。金属离子与壳聚糖起配合反应后，壳聚糖链发生折叠，使得高分子壳聚糖链在特定部位的断裂更容易发生。壳聚糖金属配合物中配位键的存在可能使得壳聚糖的分子间作用力和分子内某些键发生改变，形成有利于壳聚糖分子链断裂的弱势结构。以上研究，为金属配位壳聚糖定位降解的可行性提供了佐证。

另一方面，引入超声、磁场、微波场等物理作用，会对壳聚糖的相关反应过程产生不可忽视  的影响。已有微波促进Cu(II)、Ca(II)、Zn(II)离子与壳聚糖配合，以超声波作用于壳聚糖，可提高了壳聚糖对Fe(II)的吸附量，一定强度的磁场对木瓜蛋白酶降解壳聚糖的反应有促进作用等研究报道。

发明内容

本发明针对上述技术缺点，提出一种物理场强化金属配位壳聚糖定位酶解方法，制备出分子量分布均匀的低聚壳聚糖-金属配合物和低聚壳聚糖。

本发明采用如下技术方案实现该目的：

本发明的物理场强化金属配位壳聚糖定位酶解方法，包括如下步骤：

(1)将壳聚糖溶于3％～5％pH为1.0～3.5的醋酸溶液中，使壳聚糖的终浓度为2～5mg/ml，再加入金属盐，其中，壳聚糖∶金属盐的摩尔比为1∶4～10，搅拌至完全溶解后，置于90～150W/cm²的超声场或50～100mT的磁场或100～600W的微波场下，作用10min～2h，最后静置9～18h；过滤，以0.5-2％甲酸溶液、丙酮-乙醇的混合溶液以及60％～75％乙醇溶液依次洗涤沉淀，至洗出液中检测不到金属离子，得到高配位的壳聚糖-金属配合物；

(2)在pH3.0～5.0、浓度为0.1～0.3mol/L的乙酸-乙酸钠溶液中，加入步骤(1)得到的壳聚糖-金属配合物，使壳聚糖-金属配合物的终浓度为10～20g/L，再加入木瓜蛋白酶，使酶的质量占溶液总质量的1～8％，在温度为35～50℃，50～100mT磁场中搅拌反应0.5～1.5h，再于磁场外搅拌反应6～12h；