[发明专利]鉴别尖头虫草的特征性核苷酸序列和方法

说明书

技术领域

本发明属于利用分子生物学方法检测中药材真伪的技术领域。具体的说，是用于鉴别尖头虫草Cordyceps oxycephala Penz.et Sacc.的特征性核苷酸序列以及核酸分子探针和鉴别尖头虫草的方法。

背景技术

尖头虫草Cordyceps oxycephala Penz.et Sacc.是属于虫草属(Cordyceps)的一种虫生真菌，该属真菌还包括冬虫夏草[Cordyceps sinensis(Berk)Sacc]以及蛹虫草[Cordyceps militaris(L.)Link]。野生冬虫夏草用于中药已有两千年的历史，普通民众俗称的虫草即为冬虫夏草，具有保肺肾、补精髓、化痰止劳咳的作用，常食可促进消化、调节免疫功能，增强人体抵抗力。冬虫夏草产于青藏高原，产量相对较大，但随着逐年的疯狂采挖，导致生态环境遭到破坏，引起国家重视，现已禁止采挖，引起价格的大幅上涨。但由于人工发酵菌丝生产冬虫夏草菌粉周期长达40天以上，且条件苛刻，成本很高，同时子实体至今仍然无法人工栽种，故寻找和开发冬虫夏草的替代品成为虫草资源开发与应用的重要方向。蛹虫草又称北虫草或北冬虫夏草，具有益肺肾，补精髓，止血化痰的功能，与冬虫夏草具有相似的温补特性，同时含有冬虫夏草中含量极低的虫草素。由于蛹虫草菌丝的发酵生产以及子实体的栽培均比冬虫夏草容易，故蛹虫草的生产与栽培已形成相当的规模，市场销售有了突破性的增长。尖头虫草与前面两者具有相似的功能，而且菌丝发酵与子实体栽培都很容易，完全具有开发为虫草新产品的价值。因此可以快速而准确的鉴别尖头虫草菌丝、子实体以及相关制品真伪的方法和技术将对于尖头虫草生产相关企业以及相关检验机构具有重要的意义。

DNA是生物储存遗传信息的物质，每个生物物种乃至个体均具有独特的特征性核苷酸序列，可以作为该生物物种或个体区别与其他物种或个体的标志。DNA是细胞生物的基本组成部分，作为遗传信息的载体，具有一定的稳定性，不会受表形的影响而改变，是用来鉴别物种、个体的可靠依据。通过生物信息学的分析可以找到不同物种或个体的特征性核苷酸序列，利用分子生物学的手段对该序列进行探测即可快速、准确的对物种或个体进行鉴别。目前，已有用于鉴别冬虫夏草的核苷酸特征性序列获得专利，但并未见与尖头虫草鉴别相关的核苷酸特征性序列的专利。

发明内容

本发明提供利用分子生物学手段鉴别尖头虫草的所需的特征性核苷酸序列以及方法，它可以直接从遗传本质上鉴别尖头虫草菌丝、子实体以及相关制品的真伪。具体包括：1、用于分子鉴别尖头虫草的特征性核苷酸序列；2、来源于上述特征性序列的尖头虫草专一性核苷酸分子探针；3、包含上述分子探针的用于鉴别尖头虫草的试剂盒；4、利用上述特征性核苷酸序列、核苷酸分子探针以及试剂盒鉴别尖头虫草的方法。

本发明提供的用于分子鉴别尖头虫草的特征性核苷酸序列来源于尖头虫草核糖体rRNA内转录间隔区(以下简称ITS)以及5.8S rRNA基因(核糖体rRNA内转录间隔区以及5.8S rRNA基因合并简称ITS区)，其序列(SEQ ID NO.1)所在位置以及特征见图1及序列表，该序列包含尖头虫草的ITS1、5.8S rDNA以及ITS2的序列。该序列可通过实施例1所述方法获得，亦可通过人工合成的方法在商业化的DNA合成仪器上按照发明人提供的核苷酸顺序合成。

本发明的尖头虫草专一性核苷酸分子探针是以上述尖头虫草的特征性核苷酸序列(SEQ ID NO.1)为模板而设计得到的全长序列或不少于16个核苷酸组成的寡核苷酸序列，以及在上述全长序列或寡核苷酸序列的基础上经修饰、加工、变化而获得核苷酸序列，也包括在上述全长序列或寡核苷酸序列的基础上在5’端添加或改变10个核苷酸以下或改变原有核苷酸序列数量小于10％以及3’端6个核苷酸改变不足1个核苷酸的核苷酸序列。上述序列可通过DNA自动合成仪等DNA合成装置按照设计好的顺序合成而获得，并可以通过酶、同位素、生物素、化学荧光素、荧光剂等方式进行标记。

本发明提供了优选的两个尖头虫草专一性核苷酸分子探针Probe I及Probe II，其序列分别为SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3，其具体位置见图2。该序列同样适用于上述修饰、加工与变化、添加酶切位点、改变部分核苷酸序列以及标记等操作。

本发明提供的上述探针具有极高的专一性，可以与尖头虫草发生专一性的反应而不与其他种类的虫草或其他真菌发生反应。利用上述探针通过PCR的方法或核酸杂交的方法可以快速的对尖头虫草的菌丝、子实体以及相关的制品进行检测，从而快速鉴别尖头虫草。