[发明专利]虎纹捕鸟蛛蛋白酶抑制剂

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶抑制剂，具体涉及一种由蜘蛛毒素突变后获得的蛋白酶抑制剂。

背景技术

蛋白酶抑制剂广泛存在于动物毒液、植物和微生物中，具有能被开发成有利于人类健康的新药应用前景。如，Kunitz型(一种结构模体的名称)丝氨酸蛋白酶抑制剂BPTI(牛胰蛋白酶抑制剂)，它是到目前为止发现的世界上活性最强的蛋白酶抑制剂之一，它通过与酶的活性位点结合而抑制蛋白酶的活性，因而在治疗胰腺炎、烧伤后休克、产后大出血、急性循环衰竭、出血性脑水肿、手术中及创伤后出现的纤溶亢进性出血的防治等领域都表现出很好的疗效，在爱滋病的治疗方面也有一定的临床应用。中国专利ZL200310110608.1公开的虎纹捕鸟蛛毒素-XI也是一种抑制作用较强的胰蛋白酶抑制剂。但是这种抑制剂在后面的实验中发现还同时具有一定的钾离子通道阻断活性，这个活性对开发成为蛋白酶抑制剂方面的药物是没有意义的，甚至还可能存在某些未知的副作用。因此如何获得一种抑制作用和抑制专一性都很强的蛋白酶抑制剂，来满足新药开发和人类健康的需要，是值得研究的问题。

发明内容

本发明旨在于提供一种抑制作用和抑制专一性都很强的蛋白酶抑制剂。

本发明提供的这种蛋白酶抑制剂是将虎纹捕鸟蛛毒素-XI的第6位亮氨酸突变为丙氨酸，得到虎纹捕鸟蛛毒素-XI的突变体，该突变体的氨基酸序列为：

Ile Asp Thr Cys Arg Ala Pro Ser Asp Arg Gly Arg Cys Lys Ala Ser Phe Glu Arg Trp Tyr Phe Asn

Gly Arg Thr Cys Ala Lys Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gly Asn Lys Phe Pro Thr Gln Glu

Ala Cys Met Lys Arg Cys Ala Lys Ala

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

附图说明

图1是虎纹捕鸟蛛毒素-XI突变体(mHWTX-XI)的离子交换高效液相色谱纯化图谱，0.3M的为目的峰。

图2是虎纹捕鸟蛛毒素-XI突变体的反向高效液相色谱纯化图谱(2-a)，其中标记为b的是突变体的质谱鉴定图谱。

图3是虎纹捕鸟蛛毒素-XI突变体(mHWTX-XI)抑制胰蛋白酶的浓度依赖性图谱

图4是通过等温滴定量热法得到的虎纹捕鸟蛛毒素-XI突变体(mHWTX-XI)与胰蛋白酶的相互作用图谱。

图5是BPTI与胰蛋白酶的相互作用图谱。

图6是虎纹捕鸟蛛毒素-XI突变体及虎纹捕鸟蛛毒素-XI抑制离子通道Kv1.1的图谱

虎纹捕鸟蛛毒素-XI突变体(mHWTX-XI)通过基因表达的途径获得，具体操作如下：

将虎纹捕鸟蛛毒素-XI(见中国专利ZL200310110608.1)第6位亮氨酸突变为丙氨酸，根据虎纹捕鸟蛛毒素-XI的成熟蛋白序列结合突变位点情况设计引物pa：5’-CGTCTAGATAAGAGAATAGATACATGCCGTGCACCCTCT GACCGTGG  -3’和pd：5’-CCGAAGCTTTATGCTTTTGCACATC-3’，以虎纹捕鸟蛛毒素-XI的cDNA为模板(见中国专利ZL200310110608.1)进行基因扩增，扩增反应体系为：

A.10xPCR缓冲液            5.0μl

B.25mM MgCl₂             3.0μl

C.10mM dNTP Mix           1.0μl

D.10μM pa                1.0μl

E.10μM pd                1.0μl

F.HWTX-XI的cDNA合成液     1.0μl

G.Taq酶                   0.4μl

H.ddH₂O                  至总体积50.0μl

扩增条件

94℃预变性5min

94℃变性1min，52℃退火1min(30个circle)

72℃延伸5min