[发明专利]基于连接子聚合酶链式反应和磁性纳米粒子的单核苷酸多态性检测方法

说明书

所属技术领域

本发明涉及一种应用连接子聚合酶链式反应(Linker-PCR)和磁性纳米粒子的基因检测技术，尤其是一种多位点的单核苷酸多态性(SNP)的检测方法

背景技术

随着人类基因组测序工作的完成，人类基因组的DNA序列已被初步地测定和分析，现有的研究结果表明，人类基因组约含有3万～4万个蛋白质编码基因，全面深入地了解个体和群体间基因组的变异或多态性已成为可能，并日益显示其重要性。人类基因组中的遗传多态性较多地表现在重复序列，特别是短串联重复序列，如小卫星DNA和微卫星DNA，它们的多态性主要是基于重复序列拷贝数的变异。另一类更加普遍的多态性是基因组中散在的单个碱基的不同。这种不同虽然也包括单个碱基的缺失和插入，但更多的是单个碱基的置换，即单核苷酸的多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)。SNP为数众多，分布广泛。随着人类基因组计划的进展，人们愈来愈相信基因组中的这类多态性有助于解释个体的表型差异、不同群体和个体对疾病，特别是对复杂疾病的易感性、以及对各种药物的耐受性和对环境因子的反应。因此，研究SN P已成为人类基因组计划的内容和目标之

近年来，国内外有关SNP分型检测技术正成为研究热点，新的SNP检测方法层出不穷，如以分子构象不同为基础的检测方法，包括测序法、单链构象多态性分析、限制性长度多态性分析、变性高压液相色谱等；以荧光共振能量传递，包括Taqman法、分子信标(molecularbeacons)法、侵入法(Invader assay)等；此外还有以分子杂交技术为基础的检测方法，包括等位基因特异性寡核苷酸探针杂交法、动态等位基因特异性杂交法、寡核苷酸连接法，基因芯片法等；除了以上三大类方法以外，还有如质谱法、AFM法单个碱基延伸标记法。

目前，SNP与复杂疾病的遗传易感性已经成为的SNP研究重点。复杂性状的形成受许多微效加性基因的作用，与疾病相关的单个SNP不能引起疾病，而是一系列易感性主基因上存在的SNP群的共同作用以及环境因素的影响决定某一个体是否患某种疾病。而要进行这方面的研究，就需要能够简便地不同基因的多个SNP的基因型在年龄、种族相匹配的病人和对照人群中的发生频率，因此要对大量的样本的多个SNP位点进行快速、低成本的基因分型。但是现有的各种SNP检测方法很难满足这种需求因此，探索和建立高效、低成本、高通量且适合于临床应用的多位点SNP检测方法是十分必要的。

随着纳米技术的迅速发展，纳米材料广泛应用到生命科学领域，为其研究和发展提供了新的技术和手段。磁性纳米粒子(MNPs)作为纳米材料的一个重要组成部分，由于其特殊的物理化学性质和生物相容性，目前已被广泛应用于细胞的分离、免疫测定、蛋白质和酶的固定以及DNA的检测等。磁性纳米粒子在溶液中较好的扩散型，高的表面积以及特殊的磁分离性质使其在核酸检测方面具有非常广阔的应用前景。

发明目的

本发明的目的是为了提供一种利用连接子聚合酶链式反应(Linker-PCR)对样本进行全基因组扩增，再利用磁性纳米粒子做为扩增产物载体针对基因组中多个单核苷酸多态性位点(SNP位点)进行分析的分型检测方法，该方法利用了Linker-PCR和磁性纳米粒子的优点，能够简便、高效、准确地实现对大量样品多个SNP位点分型。

发明内容

本发明的目的通过下述方案实现：

基于磁性纳米粒子的SNP分型方法，包括下述步骤：

(1)选取多个待检测的重要功能SNP位点。针对每个待测位点设计两条分别与两种等位基因互补的野生和突变检测探针，待检测位点位于探针序列的中间且每条探针的一端带有标记物。

(2)限制性内切酶消化：基因组DNA用足量的限制性内切酶消化成短片段。选取的内切酶的识别序列避开了绝大部分SNP位点，因此经该酶消化后，各个基因的功能SNP位点基本保持完整。消化产物经纯化试剂盒纯化。

(3)设计、制备连接子Linker。Linker是由两条互补的寡聚核苷酸链构成，且互补两序列后形成与酶切切口互补的粘性末端。其中一条寡核苷酸5’端标记有生物素。

(4)将制备好的Linker通过T4DNA连接酶连接到纯化后的消化产物未端。

(5)以步骤(3)中生物素标记的寡核苷酸为扩增引物在多孔板中进行Linker-PCR扩增。

(6)将扩增产物固定到磁性颗粒上，然后将带有PCR产物的磁性颗粒均匀的分到不同的反应管中，经变性、洗涤后，各管中固定在颗粒表面的单链DNA(ssDNA)与不同SNP位点的检测探针在特定温度下杂交。