[发明专利]对核酸分子多片段基因进行平行检测和实时定量分析的方法

说明书

技术领域

本发明涉及到核酸的检测，基因诊断，基因序列分析，基因类型及多态性的分析， 以及基因表达的分析等生物技术领域。特别是在多个基因的检测上，以及多个基因的 点突变检测或是单碱基多态性分析上。

背景技术

在基因检测或是核酸序列分析中，通常要检测不同基因片段或是不同核酸区域上 的多个基因序列，甚至在这些片段或区域中少到一个基因位点的突变或是单个碱基多 态性变化。多重PCR(multiple PCR)能对多个基因片段进行扩增，但扩增后很难分 析扩增出的片段是所需检测的序列。且多重PCR中引物之间容易相互干扰，因而扩 增条件难以优化，扩增片段数受到限制。多重PCR扩增后通过DNA微阵列检测，能 较好的分析扩增序列是否为所需检测的基因序列，但操作较为繁琐，且准确率不高。

因此，本领域中需要开发出一种操作简便、重复性好、准确率高的检测多个基因 片段或多个核酸区域的方法。

发明内容

本发明者经过深入研究，建立了能同时对多个基因片段或是多个核酸区域进行实 时检测定量分析的方法，并且能检测这些基因片段或核酸区域中的点突变和单碱基多 态性。

为实现上述目的，本发明提供了一种平行测定样品中多个基因片段或是多个核酸 区域的存在或量的方法，该方法包括以下步骤：

a)提供样品液，所述样品液中包含待检测的基因片段或核酸区域；

b)提供固相载体，所述载体表面不同的位置固定了多种核酸探针分子；

c)提供至少一对一级引物，所述一级引物对中的至少一个引物包含与所述待测 核酸分子互补的区域和不互补的区域；

d)提供至少一对二级引物，所述二级引物对中的至少一个与所述一级引物对中 的所述至少一个引物的不互补区域的序列匹配；

e)使所述样品液、固相载体、一级引物、二级引物相互接触；

f)对所述样品中的待检测的基因片段或核酸区域进行扩增，在扩增反应时，用 荧光基团标记扩增产物；

g)使所述扩增产物在扩增反应中和所述核酸探针分子相互杂交；

h)激发所述杂交上的扩增产物上的荧光分子，检测此荧光信号的位置和强度， 从而确定样品中多种核酸分子的存在或量。

在一个较佳的实施方案中，所述核酸探针分子通过化学键连接、物理吸附、聚合 物包埋、蚀刻或粘联的方式固定在载体表面。

在另一较佳的实施方案中，所述核酸扩增反应包括通过DNA聚合酶、DNA反 转录酶、RNA聚合酶、或是同时有多种这些酶参与的复制待测核酸分子片段的反应。

在另一较佳的实施方案中，所述一级引物每种的浓度是1pM-10nM，更优的是 0.1-1nM。

在另一较佳的实施方案中，所述多个基因片段或多个核酸区域是同一基因的不同 突变形式。

在另一较佳的实施方案中，在所述步骤f)中，通过使用有荧光基团标记的脱氧核 苷三磷酸、有荧光基团标记的引物或其组合使扩增产物被荧光基团标记。

在另一较佳的实施方案中，所述激发杂交上的扩增产物上的荧光基团的方法包括 通过倏逝场来激发，所述倏逝场通过在所述固相载体内发生的光的全内反射，或者通 过平面波导来产生。

在另一较佳的实施方案中，所述激发所述杂交上的扩增产物上的荧光分子的方法 包括通过荧光共振能量转换激发。

在另一较佳的实施方案中，所述荧光共振能量转换激发为所述扩增产物的荧光分 子被连接在所述载体表面上的荧光基团的发射光所激发，或所述荧光共振能量转换激 发为所述扩增产物的荧光分子的发射光激发连接在所述载体表面上的荧光基团。

在另一较佳的实施方案中，所述一级引物对中的至少一个引物中的不互补的区域 包含标签序列。

本发明的方法是全新的，其通过一步反应能高通量的对多个基因片段或多个核酸 区域进行检测，并且能对这些片段中的点突变和单碱基多态性进行检测和定量。更重 要的是，它有着操作简便，重复性好，不需要反应后的开管检测步骤，检测时间短的 优点，从而方便操作人员使用，并且降低样品间的交叉污染概率。同时，此技术也能 定量分析多种基因型或是基因片段。总的来说，它具有检测通量大、特异性强、灵敏 度高、重复性好、定量准确、速度快、操作简便、全封闭反应等优点，将成为分子生 物学研究以及临床检测的重要工具。

附图说明

图1为二级引物链式聚合酶扩增反应和检测示意图。