[发明专利]抗人端粒酶逆转录酶单链抗体

说明书

技术领域：

本发明属于基因工程抗体技术领域，具体涉及一种用于抑制肿瘤细胞分裂生长，诱导肿瘤细胞凋亡的基因工程单链抗体。

背景技术：

端粒、端粒酶与肿瘤的关系是近年来受到国际医学界高度重视的研究热点。肿瘤细胞尤其是恶性肿瘤细胞常常因为获得永生性而具有了无限增殖能力，而肿瘤细胞无限增殖能力的维持则依赖于端粒酶的活性。大量研究表明，各类恶性肿瘤中几乎都有端粒酶的异常高表达(Kim NW，1994)。人端粒酶是由RNA和蛋白质组成，其中人类端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)是端粒酶的催化活性亚单位(Takayara J，1998；Kanaya T，1998；Takayara M，1998)。已发现大约85％的人类恶性肿瘤具有hTERT的高表达，所以抑制人端粒酶端粒酶逆转录酶的活性为抗肿瘤药物的设计提供了新的目标。

单链抗体(single chain Fv，ScFv)是一个重要的基因工程抗体，是在DNA水平上利用基因工程方法使抗体重链可变区(V_H)基因和轻链可变区(V_L)基因通过一段约5～25个氨基酸寡核苷酸(linker)的连接肽，一般为(Gly₄Ser)₄，首尾拼接而形成的重组蛋白。具有(1)制备方法简单，成本低；(2)免疫原性弱；(3)能均匀分布于肿瘤且与抗原结合特异性强；(4)体内周转快；(5)易于进一步进行基因工程改造等特点，因此它的应用领域相当广泛，尤其在肿瘤人工免疫治疗方面。ScFv基因转染细胞表达的细胞内抗体是继反义核酸、核酶和显性负突变技术后又一巧妙的基因治疗策略，同时又是用于表型敲除研究的又一有力工具，可作用于各种靶分子。将含抗癌相关蛋白的抗体基因转染细胞，细胞表达的scFv与癌相关蛋白作用，可能间接抑制肿瘤的生长。目前这方面的研究主要集中在肿瘤细胞高表达的某些蛋白及与肿瘤细胞耐药、侵袭和转移等相关的蛋白上。人端粒酶逆转录酶的表达和激活在调节细胞生长和分化中起重要作用，因此他们也就成为抗癌治疗的新的靶标。

发明内容：

本发明的目的是提供一种抗人端粒酶逆转录酶单链抗体基因，将该抗体的编码基因导入到肿瘤细胞内部进行表达。体内表达的抗体分子与相应的催化亚基特异性结合，可阻断端粒酶装配，封闭肿瘤细胞中端粒酶逆转录酶的活性，从而抑制肿瘤细胞生长分裂，诱导其凋亡。

本发明的内容包括：利用生物工程技术，提供编码抗hTERT-scFv基因和由此推断的氨基酸序列；提供含有所述的抗hTERT-scFv基因的表达质粒和利用该质粒转化的工程菌；同时提供从所述工程菌制备重组抗hTERT-scFv的方法，以及将抗hTERT-scFv基因作为治疗对人端粒酶逆转录酶阳性肿瘤药物制剂应用。

本发明提出的重组抗hTERT-scFv基因，是由连接抗体的V_L和基因V_H，建立一个抗hTERT-scFv基因，该基因由738个碱基对组成。这种scFv的核苷酸序列为SEQ.ID.No.1。本发明的具体过程如下：

1、从稳定分泌人端粒酶逆转录酶单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取、纯化mRNA。体外反转录cDNA。

2、克隆轻链可变区基因，连入pGEM-T载体(Promega)，进行序列分析，经同源对比分析，证实该基因片段为抗体轻链可变区基因，序列为SEQ.ID.NO3。

3、克隆重链可变区基因，连入pGEM-T载体，进行序列分析，经同源对比分析，证实该基因片段为抗体重链可变区基因，序列为SEQ.ID.NO4。

4、连接抗体轻链，重链基因，以编码(Gly₄Ser)₄的连接DNA序列，连接抗体轻、重链可变区，构建抗hTERT-scFv基因，序列为SEQ.ID.NO1。

将上述scFv基因克隆到商业化的pET28a表达载体(Novagen)上，转化BL21宿主大肠杆菌，获得的转化菌株为工程菌株Rosetta/hTERT-scFv。

培养该工程菌株，经IPTG诱导表达3-4小时，利用该单链抗体上融合的6个组氨酸标签，对其进行Ni柱亲和层析纯化，咪唑浓度梯度洗脱，得到本发明的分子量为30KD的单链抗体蛋白，其序列为SEQ.ID.NO2。

TRAP-ELISA方法在体外检测纯化的hTERT单链抗体蛋白对HeLa细胞中内源端粒酶逆转录酶活性的影响。