[发明专利]多元连接酶检测反应等位基因精确分型的方法

权利要求书

1. 一种多元连接酶检测反应等位基因精确分型的方法，是通过以下步骤实现的：

根据待测序列和位点突变情况，设计一组“多元核酸引物/探针”，每组至少包括：

引物1：含该检测位点的配对碱基A，能与待测位点左端局部配对(退火)，并与该待测位点的野生型完全配对；

引物2：含该检测位点的不配对碱基C，能够与待测位点左端局部配对或退火，并不与该待测位点的野生型配对；

1条能够与待测位点右端局部配对或退火，并在5’末端带有磷酸基，同时在3’末端带有荧光标记的AMLR探针；

上述一组“多元核酸引物/探针”与待测脱氧核糖核酸序列混合，进行变性和退火，在反应体系中就可能形成两种杂交分子：

引物1与待测目标脱氧核糖核酸分子左端退火，AMLR探针与其右端退火；

引物2与待测目标脱氧核糖核酸分子左端退火，AMLR探针与其右端退火；

用Taq脱氧核糖核酸连接酶进行连接反应，则对于上述2种杂交分子会产生不同的结果：

由于引物1与待测目标脱氧核糖核酸分子左端和待测位点均能够完全退火，与右端退火的AMLR探针之间不会形成缺口，能够完成连接反应，形成连接产物；

由于引物2与待测目标脱氧核糖核酸分子的待测位点不能够实现退火，与右端退火的AMLR探针之间会形成单碱基不配对区，不能够完成连接反应，无法形成连接产物；

将反应体系进行热变性，只能得到引物1-AMLR探针的有效连接产物；

对反应体系进行多聚酶链式反应，扩增引物1-AMLR探针的量即可供荧光检测或电泳检测。

对于突变型待测样本得到与上述相反的结果，即：形成引物2-AMLR探针连接产物；

对于一个待测位点只存在两种等位基因形式的群体样本，最都可能会有三种检测结果：即单一的长扩增片段、单一的短扩增片段、长短扩增片段；

如果待测位点具有多个突变形式，则在设计上只需增加相应特定引物的种类，无须改变AMLR探针；如需要改变检测位点，则二者的设计都应作相应改变。