[发明专利]亚甲蓝光化学病毒灭活效果质量评价方法及其质控品

说明书

技术领域

本发明涉及血液及血液成分病毒灭活效果的质量评价方法，及相应质控品的建立，具体涉及亚甲蓝光化学病毒灭活效果质量评价方法及其质控品。

背景技术

随着医学科学的发展，血液及血液制品的安全性越来越受到重视，血液安全性不仅依赖于合理的献血员筛选，严格的病毒筛检，还有赖于安全有效的病毒灭活技术，它是安全输血的重要保障。亚甲蓝(Methylene blue，MB)光化学法被认为是非常有发展前景的临床用单人份血浆病毒灭活方法。由于病毒灭活技术受多种条件因素影响，如MB的浓度、光照强度、时间及光源波长等，因此建立病毒灭活有效性验证手段，直接而客观地评价病原体灭活的有效性是病毒灭活工作的重要组成部分，是确保灭活效果达到预期的要求，保障血液制品安全性、有效性的重要环节。

目前多采用体外培养的细胞病变法或动物模型方法来判断病毒灭活效果。细胞病变法就是通过病毒接种于细胞悬液中，观察宿主细胞变化来判定病毒感染的情况。目前除HIV已建立起成熟的实验室细胞病变方法加以检测外，HBV、HCV等都不能直接体外繁殖，必须尽可能选择理化性质相似的模型病毒作为指示病毒进行体外培养加以检测，如以辛德毕斯病毒(Sindbis Virus，SV)作为HCV模型病毒、鸭乙肝病毒(Duck Hepatitis B Virus，DHBV)作为HBV的模型病毒、水疱性口炎病毒(Vesivular Stomatitis Virus，VSV)作为RNA脂质包膜病毒的模型病毒。但是体外培养方法对实验条件有严格的要求，细胞培养、病毒保存有规范的控制，操作繁琐，实验周期长，不利于在基层单位开展此项工作。此外，虽然动物模型方法在从生物体整体水平评价病毒感染性方面具有优势，但价格昂贵，实验周期长，只适合于研究开发阶段使用，也不适合在常规工作中开展。因此，建立更简单易行、更经济、更有效的评价指标已成为病毒灭活工作中急需解决问题。

核酸检测技术是以检测感染者体内病毒核酸的有无或含量多少来进行病原学诊断的一种方法，是继形态学、生物化学和免疫学诊断之后的第四代诊断检测技术。它具有灵敏度高，特异性强，能采用定量检测的方法进行质量控制，准确性高，检测费用少，检测耗时少，适合于常规工作中推广应用。PCR是众多核酸检测技术中的经典方法，因其简便快速的特点，目前基层检验单位及血站均已具备PCR工作条件。因此发明人想到了可能可以利用核酸检测技术来评价亚甲蓝光化学病毒灭活效果。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种新的利用核酸检测技术来评价亚甲蓝光化学病毒灭活效果的方法。

要给出利用核酸检测技术来评价亚甲蓝光化学病毒灭活对病毒的灭活效果的方法，有几个关键：

首先，因为PCR检测的是病毒特异性靶基因片段，所以必须证明亚甲蓝对病毒灭活作用位点为病毒核酸，并且病毒这种特异性扩增产物的减少或消失与病毒感染的致病性存在一定的相关性。

其次，由于常规采供血工作对环境的严格要求，引入的质控品材料必须保证对操作人员和受血者无感染性，因此，必须选择对人体不致病，但又能模拟对人体致病的HBV、HCV和HIV在处理过程中动态变化的模型病毒或相关病毒的核酸材料作为质控品的备选对象。

最后，必须筛选出与亚甲蓝光化学病毒灭活相关的，能敏感反映病毒感染性的靶基因扩增片段及其引物，以达到该方法有效推广的目的。

在证实了亚甲蓝对病毒灭活作用位点为病毒核酸，并且病毒这种特异性扩增产物的减少或消失与病毒感染的致病性存在一定的相关性后，本发明提出了以下技术方案：

一方面，本发明公开了一种亚甲蓝光化学病毒灭活效果质量评价的检测方法：

在对血液或血液制品进行亚甲蓝光化学灭活的同时，对质控品进行相同条件的灭活，质控品含有VSV病毒完整颗粒或VSV病毒基因的重组质粒或VSV病毒基因体外转录的RNA片段，通过特异性引物，利用PCR技术扩增质控品中VSV病毒基因的特定区域，通过对PCR结果的监测，从分子水平对亚甲蓝光化学病毒灭活效果进行质量评价。