[发明专利]水稻OsCS编码序列及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学、生理学以及基因工程技术领域，具体涉及一种在水稻中表达的柠檬酸合酶(水稻柠檬酸合酶，citrate synthase，OsCS)的克隆，拷贝数分析，基因表达模式分析，转基因载体的构建，植物转化，转基因植株的获得以及相应的生理生化特性的鉴定。

背景技术

世界上有近40％的耕作土壤受到酸雨的侵蚀。其中铝(Al)毒是酸性土壤限制作物产量的关键因素。采用遗传工程手段培育优良品种适应不良土壤具有一定应用潜力。根系分泌的有机酸对植物吸收矿质营养具有一定的重要性。尤为重要的是，分泌有机酸提高了植物对铝毒的抗性，主要是有机酸可螯合根区铝离子，减少了铝进入细胞的量，因此使植物免遭铝毒伤害。有机酸与抗铝毒具有密切关系，在拟南芥、燕麦和小麦等物种中都有相关的报道。进行铝毒处理，不同植物以及同一植物的不同品种间，分泌有机酸的种类与能力均有所不同，主要包括柠檬酸、苹果酸、琥珀酸和草酸等。

由于柠檬酸在抗铝毒上的有效性，柠檬酸合酶已成为目前研究的热点。柠檬酸合酶是线粒体内三羧酸循环和质体内乙醛酸循环起始反应中的酶，催化CoA和草酰乙酸生成柠檬酸。生成的柠檬酸不仅作为代谢的中间产物，同时其分泌植物体外具有螯合毒素离子的作用。因此，柠檬酸合成的关键酶-柠檬酸合酶的基因克隆与转基因工作也显得尤为重要。目前已在拟南芥和胡萝卜等植物品种中分离到柠檬酸合酶编码基因，并多为线粒体特异表达。柠檬酸合酶基因的遗传转化功能证明此基因的表达可提高转基因植株的柠檬酸的分泌量和植物的铝毒抗性。

本发明研究了一种从水稻中克隆催化生成柠檬酸的柠檬酸合酶(OsCS)，转入烟草后提高柠檬酸分泌量的技术。应用该技术不仅可提高铝毒处理下植物中柠檬酸分泌量，预期可以使植物在铝含量较高的土壤环境下正常生长，同时可能提高磷的有效利用率，可扩大植物(如水稻)等的栽培范围。

在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中提及的水稻OsCS序列及其核酸序列。

发明内容

本发明的第一目的就是提供一种新的水稻基因OsCS，该基因是一个线粒体的柠檬酸合酶基因。

本发明的第二目的是提供这种水稻蛋白OsCS编码序列在利用转基因技术提高植物柠檬酸分泌量，以及铝毒抗性的应用。

本发明一方面提供一种分离出的DNA分子，其编码水稻柠檬酸合酶的开放阅读框，具体见SEQ ID NO.1的核苷酸序列。

本发明的另一方面还提供，上述序列编码的具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。

本发明还提供了一种检测OsCS mRNA时空表达模式的方法，其步骤如下：

(1)取水稻幼苗(两叶一心期)叶片和根，固定，石蜡切片。

(2)利用OsCS的开放读框的RNA为探针，杂交显色。

本发明还提供了一种利用转基因技术将编码具有水稻OsCS酶活性的核苷酸序列转化入烟草以提高柠檬酸分泌量的方法，其步骤如下：

(1)将水稻OsCS基因的开放读框连于植物表达载体，形成含有水稻OsCS基因(SEQID NO.1的核苷酸序列)的植物表达载体；

(2)将步骤(1)中的表达载体转入农杆菌，将含表达载体的农杆菌同烟草叶片共培养，在25±2℃条件下，暗培养2天；

(3)通过抗生素筛选，PCR鉴定，获得水稻OsCS基因的转化细胞并再生转基因植株。含有水稻OsCS基因的转基因植株的柠檬酸分泌量有较大程度的提高。

本发明还提供了一种检测样品中水稻柠檬酸合酶拷贝数的方法，它包括用SEQ IDNO.1所示序列与样品杂交，然后检测探针是否发生了结合。该样品是水稻和转基因烟草基因组DNA，经限制性内切酶酶切后的核苷酸序列。

这里所述探针为下述核酸分子，它包含SEQ ID NO.1所示的DNA分子中第893-910个连续的核苷酸和第1405-1425个连续核苷酸的反向互补序列。

本发明还提供了一种检测样品中水稻柠檬酸合酶表达模式的方法，它包括用用SEQ IDNO.1所示序列制备探针，并与样品进行杂交，然后检测是否发生了结合。该样品是水稻幼苗叶片和根的石蜡切片。

本发明还提供了一种鉴定转基因烟草的核酸分子，它包括用前述核苷酸序列与样品进行PCR反应，然后检测是否扩增出目的片段；样品为转基因烟草基因组DNA。

本发明的另一方面，还提供了一种测定转基因烟草柠檬酸分泌量的方法，其步骤如下：