[发明专利]重组人促卵泡生长激素的生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域。更具体地，本发明提供了一种高效生产重组人促卵泡生长激素(FSH)的方法，包括有关的CHO细胞株的构建、重组人促卵泡生长激素的表达和纯化工艺。

背景技术

重组人促卵泡生成素(FSH)是由脑垂体嗜碱性细胞分泌进入血液循环的一种多肽激素，该激素与脑垂体分泌的另一激素一一黄体激素(Lnteinzinghormone，LH)，共同作用于女性卵细胞，控制卵细胞的成熟，其中FSH起着关键调节作用，是卵泡细胞发育成熟不可缺少的因子。

FSH是由双链形成的多肽糖蛋白，包括α链和β链，该二条亚链由非共价键联结，分别由不同的基因转录而来。α链含有92个氨基酸，β链含有111个氨基酸。α链和β链在转录后都经过糖基化，研究表明，该蛋白质糖基化对其生物活性十分重要，是其发挥活性作用的关键。因此，必须采用真核细胞系统表达，该蛋白质才有活性。并且，α链和β链必须成比例共同表达于一个细胞株内，方能达到完全活性的FSH。

不能释放卵子是女性不育最常见的原因，占所有不孕妇女的1/3左右，其主要原因是由于患者在月经中期，下丘脑刺激垂体释放的促卵泡生成素(FSH)不足或相对不足，从而导致卵巢不能产生成熟的卵子或不能引起排卵。促卵泡生成素(FSH)是第一种用于治疗这类不孕症的生物药，目前应用中主要有人基因重组FSH(r-FSH)与高纯度人尿PSH(u-FSH-HP)，u-FSH-HP是由绝经期妇女尿液中提取的，纯度达95％，但仍含有残留尿液中的具有蛋白性质的成分，这些成分可抑制FSH的作用。rh-FSH是近年来应用基因工程技术人工合成的纯度达100％的FSH制剂。u-FSH-HP与rh-FSH不仅在来源上不同，而且在结构上也不完全相同，如它们的寡糖分子结构不同，免疫反应生物活性不同，rh-FSH比u-FSH-HP的碱性形式多，酸性形式少，前者对受体的亲和力更强，自身的生物活性也更。碱性形式在诱导卵泡生长中起重要作用，在自然月经周期中，月经中期FSH的碱性形式较多，说明rh-FSH更接近天然FSH，具有更高的生物活性。由于尿促性腺激素生物活性存在20％的内变异，751U的u-FSH可能含有60~90IU的变异，说明u-FSH活性不如rh-FSH稳定。

因此，迫切需要开发高效生产重组人FSH的方法，本发明采用了CHO(dhfr^-)表达系统表达FSH，通过对人FSH基因的优化，构建含有优化的人FSH基因的表达载体，并获得了高水平的表达细胞株；通过控制培养条件，达到了较高蛋白表达率；在此基础上对表达的rh-FSH的纯化进行了大量的摸索和研究后，得到了高纯度、高得率、可供动物实验的rh-FSH蛋白。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高效和/或简便的生产重组人促卵泡生长激素的方法。

本发明的另一目的就是提供优化的重组人促卵泡生长激素的氨基酸序列和用于该方法的表达载体及工程细胞。

在本发明的第一方面，就是提供了一种优化的编码重组促卵泡生长激素的氨基酸序列，其特征在于，所述的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

在本发明的第二方面，提供了一种表达载体，含有权利要求1所述的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的表达载体是pET30a(+)/FSH。

在本发明的第三方面，提供了一种工程细胞，其特征在于，含有权利要求2所述的表达载体。

在另一优选例中，所述的工程细胞是CHO(dhfr^-)，是二氢叶酸还原酶的基因缺陷细胞株，非常适合外源基因的高效表达。

在本发明的第四方面，提供了一种生产重组人促卵泡生长激素的方法，该方法包括步骤：

a)在适合的表达条件下，培养如权利要求4所述的宿主细胞，从而表

达出人促卵泡生长激素；较佳地，所述的宿主细胞是CHO(dhfr^-)。

b)分离纯化出表达的人促卵泡生长激素。

在本发明的另一优选例中，所述的步骤(a)的培养条件包括：

培养分为有血清培养阶段和无血清阶段，有血清培养阶段细胞进行扩增达到一定密度后，更换无血清培养基进行表达，灌注培养收集培养上清。培养温度保持在37℃，pH值控制在7.0±0.2，搅拌速度80rpm，溶氧(DO)50％。