[发明专利]一种表面固定金属离子的磁性微球及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属无机材料合成及生化分析技术领域，具体涉及一种具有超顺磁性的表面固定金属离子的磁性微球及其制备方法和应用。

并以其作为微吸附剂，可对复杂肽段混合物中的磷酸化肽段实现高选择性富集，并对富集的样品直接进行基质辅助激光解析离子化质谱的分析和鉴定，进而实现磷酸化位点的鉴定。可使用于该类磁性微球的合成及适用于复杂肽段混合物中磷酸化肽段的有效富集及磷酸化位点的鉴定。

背景技术

蛋白质的磷酸化是蛋白质翻译后修饰研究领域的热点之一。蛋白质的磷酸化和去磷酸化过程调节着细胞信号转导，细胞分化和细胞生长等几乎所有的生命过程。细胞中所有的蛋白质有大约三分之一是磷酸化的，因此发展磷酸化蛋白的研究方法对于认识生命活动过程具有重要的意义。近年来，基于基质辅助激光解析的飞行时间质谱成为磷酸化蛋白结构解析的强大辅助工具。但在质谱分析中，由于磷酸化肽段离子化效率低，因此其信号往往被非磷酸化肽段所抑制，这对磷酸化肽段的鉴定提出了挑战。在质谱分析前先对磷酸化蛋白或肽段进行专一的分离富集为磷酸化蛋白的结构解析提供了有效的解决方法。固定金属离子螯合色谱(IMAC)是该方面目前研究的热点。通过固定在多孔树脂上的金属离子和磷酸化肽段或蛋白的磷酸根离子之间的静电相互作用实现分离富集。但是该富集过程中，从树脂上洗脱样品时会造成的样品损失以及操作方法相对繁琐，因此对其进行改进是十分必要的。

磁性聚合物微球以其本身特有的物理、化学性质以及在细胞分离、磁辅助给药和酶固定等众多领域中的潜在应用前景而得到了广泛的关注。磁性聚合物微球融合了磁性材料的磁响应特性和微球聚合物材料的高分散性等优点，使得其对痕量肽段的富集成为可能。现有研究表明：由于聚合物材料的包覆造成材料的磁感应强度大大下降，从而限制了该类材料在痕量物质的分离富集领域的发展应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简单、效率高、效果好，能对痕量磷酸化肽段进行高选择性富集及直接进行质谱分析的表面固定有金属离子的磁性微球及其制备方法和应用。

本发明提供的表面固定有金属离子的磁性微球，是在超顺磁性Fe₃O₄微球表面以溶胶凝胶法包覆二氧化硅，然后采用(2，3-环氧丙氧基)丙基三乙氧基硅烷、亚氨基二乙酸对其表面进行化学修饰，进而固定金属离子而获得，其结构如下式所示：

式中，F1表示四氧化三铁磁性微球，Si2表示磁球外面包覆的二氧化硅层；M表示表面固定的金属离子；

这些金属离子M可以是Fe³⁺、Al³⁺、Ga³⁺、In³⁺、Ce³⁺、Zr⁴⁺、Ni²⁺或Cu²⁺等。用于磷酸化肽段富集的磁球外部固定的金属离子可以是Fe³⁺、Al³⁺、Ga³⁺、In³⁺、Ce³⁺或Zr⁴⁺等。

上述表面固定金属离子的磁性微球的制备方法如下：

(1)用水热法合成Fe₃O₄超顺磁性微球，其步骤为：采用2.0-5.0克FeCl₃·6H₂O为原料，以40-100mL乙二醇为分散体系，添加5-10克无水乙酸钠，反应温度为190-210℃，反应时间为8-24小时，生成四氧化三铁磁性Fe₃O₄微球，其粒径是100-300nm。

(2)采用溶胶凝胶法在上述微球表面包覆二氧化硅，其步骤为：首先对水热法合成好的磁性微球进行表面活化，取10-100mg；加入1-3M的稀盐酸溶液超声分散5-15分钟；磁分离后加入10-40mL去离子水、50-250mL乙醇、1-3mL氨水，超声分散5-15分钟；机械搅拌同时加入0.05-3mL正硅酸乙酯，温度20-40℃，搅拌8-18小时。磁分离收集，水和乙醇清洗，40-60摄氏度真空干燥12-24，得磁性硅微球，其二氧化硅包覆层厚度为20-100nm；