[发明专利]结核分枝杆菌快速药敏试验方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种结核分枝杆菌快速药敏试验方法，特别是ATP生物发光技术快速检测结核分枝杆菌中ATP浓度的方法，属于微生物检测领域。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌(简称结核杆菌)主要经呼吸道传播引起的全身慢性传染病。全球目前约有20亿人感染结核杆菌，其中500多万人感染耐药结核杆菌，3％的结核新病例与HIV感染有关，现有患者2000多万例，其中95％发生在发展中国家。中国是22个结核高发国家之一，结核病患者的人数占世界结核病人数的1/4。而我国结核病人中具有耐药菌株的患者高达28％-41％，远高于其他国家。耐药结核菌株的增加给结核病的防治带来了极大的困难。临床上已经证实耐药菌株的形成是由于不合理的治疗所致，因此合理地进行临床治疗非常重要。准确的药敏试验结果是指导临床合理使用抗结核药物的前提，所以药敏试验在结核病的防治工作中起着关键作用。

传统的结核药敏试验是将抗结核药物按一定的稀释度加入到罗氏固体培养基中，然后将分离培养出的结核杆菌接种于含有药物的培养基中，观察结核杆菌在培养基中的生长情况进行判断。由于结核杆菌生长缓慢，这种传统的方法通常需要4-6周的时间才能报告药敏试验结果，所以无法及时为临床合理用药提供指导。因此缩短结核药敏试验的时间已成为一个迫切需要解决的问题，而快速、灵敏的结核药敏试验则是控制结核病的首要条件。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种结核分枝杆菌快速药敏试验方法，该方法快速、敏感，试验结果报告时间通常不超过10天，以解决现有技术的不足。

本发明的技术方案：该方法是将分离培养出的结核分枝杆菌接种至含有不同抗结核分枝杆菌药物剂量的培养基中，然后分别在接种后的不同时间，取适量样品加入三磷酸腺苷裂解剂或者三磷酸腺苷裂解剂与荧光素-荧光素酶溶液混合物，通过荧光素-荧光素酶生物发光系统检测结核分枝杆菌中的三磷酸腺苷量来判断结核分枝杆菌的生长情况，与不含抗结核分枝杆菌药物的参考株进行对比，以此来判断结核分枝杆菌对药物的反应。

所述的接种后的不同时间分别为接种后的第1、3、5、7、10天。

所述的三磷酸腺苷裂解剂中含有三氯醋酸和乙二胺四乙酸，可以破坏结核分枝杆菌细胞壁，从而释放结核分枝杆菌内的三磷酸腺苷。

加入的三磷酸腺苷裂解剂与所取样品等体积或者是等体积的三磷酸腺苷裂解剂与荧光素-荧光素酶溶液混合物。

所述的三磷酸腺苷裂解剂与荧光素-荧光素酶溶液混合物为三磷酸腺苷裂解剂与荧光素-荧光素酶溶液等体积混合而成。

所述的荧光素-荧光素酶生物发光系统检测三磷酸腺苷，是通过高灵敏度检测仪测定光的强度。

与现有技术相比，由于本发明将快速、敏感的ATP生物发光技术用于监测结核杆菌的生长情况，使其具有快速、灵敏度高等特点，全部试验结果报告时间不超过10天，可用于判断临床所分离出的结核杆菌对抗结核药物是敏感还是耐药，从而指导临床合理用药。

具体实施方式

本发明的实施例1：

1：样品采集：将肺结核病人痰液等样品中分离培养出的结核杆菌接种到含有不同剂量(浓度)抗结核药物(异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇等)的液体培养基中进行培养。

2.结核杆菌ATP抽提和ATP检测：

分别在接种后的第1、3、5、7、10天取上述液体培养基(50-500μl)至试管或微孔板中，然后加入等体积ATP裂解剂，ATP裂解剂中所含的三氯醋酸和乙二胺四乙酸，可以破坏结核分枝杆菌细胞壁，从而释放结核分枝杆菌内的ATP；反应数秒后加入荧光素-荧光素酶溶液，随后立刻采用高灵敏度发光检测仪测定光的强度进行分析测定，测定出的数值以相对光单位(RLU)表示。

本发明的实施例2：

1：样品采集：将肺结核病人痰液等样品中分离培养出的结核杆菌接种到含有不同剂量(浓度)抗结核药物(异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇等)的液体培养基中进行培养。

2.结核杆菌ATP抽提和ATP检测：

分别在接种后的第1、3、5、7、10天取上述液体培养基(50-500μl)至试管或微孔板中，然后加入ATP裂解剂和荧光素-荧光素酶，随后(5分钟内)采用高灵敏度发光检测仪测定光的强度进行分析测定，测定出的数值可以相对光单位(RLU)表示。

将测定出的ATP数值(RLU)与在不含抗结核药物培养基中培养的结核杆菌参考株进行对比，如ATP含量降低，表明为敏感株；反之为耐药株，从而指导正确用药。其中荧光素-荧光素酶生物发光系统检测ATP的检测原理：反应中荧光素被氧化并发出荧光，该光的强度与被测样品中的ATP含量成正比，通过高灵敏度检测仪测定光的强度进行定量分析即可。