[发明专利]一种检测转基因品系特异性时品系特异性序列的扩增方法

说明书

技术领域

本发明涉及遗传工程领域，更具体地说涉及一种在转基因品系特异性检测过程中扩增基因组品系特异序列的方法。

背景技术

目前，基于DNA分子为基础的转基因产品检测方法经历了四个发展阶段，即(1)针对启动子、终止子、标记基因的筛选检测；(2)目的基因特异性检测；(3)基因构建特异性检测；(4)品系特异性(转化事件)检测。由于品系特异性检测方法的高度特异性，目前国际上对于转基因产品检测方法已逐步过渡到品系特异性基因片段的检测方法。

品系特异性(Event-specific)检测：是通过分析外源插入载体与植物基因组的连接区序列实现，由于每一个转基因植物品系，都具有特异的外源插入载体与植物基因组的连接区序列，并且连接区序列是单拷贝的，所以品系特异性检测方法具有非常高的特异性和准确性。鉴于上述品系特异性转基因事物检测的优点，品系特异性检测已经成为目前转基因检测研究的重点，并将为国际检测标准和国际各检测实验室所采用。

在转基因品系特异性检测中，最重要的是获得基因组的品系特异性序列。目前获得基因组的品系特异性序列的技术有：TAIL-PCR、环状PCR、YADE法等。

TAIL-PCR：TAIL-PCR的基本原理是利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特异性引物(specialprimer，简称sp1，sp2，sp3，约20bp)，用它们分别和1个具有低Tm值的短的随机简并引物(Arbitrarydegenerateprime，AD，约14bp)相组合，以基因组DNA为模板.根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环，通过分级反应来扩增特异引物。但是TAIL-PCR仍有很多不尽如人意的地方：TAIL-PCR反应需要较多的引物组合；此外，由于随机简并引物存在有限的结合位点，对个别侧翼序列，即使使用不同的简并引物也难以扩增到阳性结果，整个反应需要一系列连续反应，条件设置要求精细；还要求引物和模板有较高的纯度，如果有降解或纯度不够，也很难扩增出特异性条带；此外，TAlL-PCR还很有可能扩增的是高度重复序列，因而无法步行利用接头的PCR克隆品系特异性序列。

环状PCR：环状PCR包括I-PCR(Inverse-PCR)和P-PCR(Panhandle-PCR)。这两种PCR都是根据一端已知序列设计的嵌套式引物进行PCR。I-PCR是1988年由Triglia最早提出的一种基于PCR的改进的染色体步行方法。I-PCR的实验程序包括：基因组DNA经酶切后用T4DNA连接酶进行自连接，产生环状DNA片段；以环化产物为底物，用根据已知片段设计的反向引物进行PCR扩增，从而得到含有未知片段的扩增产物。P-PCR是由Jones等提出的利用末端反向重复序列与已知序列互补配对形成环状单链模板，有效增强了引物与模板结合的特异性。反应需要3个根据已知序列设计的引物，3个引物在已知序列内呈线性排列，其中第3个引物可作为接头使用，可与已知序列互补配对形成锅柄状单链模板。其过程为，首先酶切基因组DNA，产生5′或3′粘末端，然后连接上合适的接头(primer 3)，连接好后最好用核酸外切酶I除去多余的接头，由于连接上的接头与已知序列是反向重复序列，变性后的DNA单链可退火形成锅柄状单链模板，之后分别用3个单引物进行3次PCR扩增，能有效地扩增2～9kbp的大片段未知序列。然而由于直接克隆已知序列外的未知DNA区域依赖于DNA的环化性，而环化连接过程中常常产生多联体，成为副产物甚至是主要产物，导致非特异扩增，造成了闭环双链的DNA的PCR扩增效率差，经常得不到满意的结果，同时酶切片段太长也会使扩增效率下降。

YADE法：Prashar等在扩增cDNA3′端时采用“Y”形接头，以减少接头引物的单引物扩增。其原理是接头引物处于“Y”接头的2个分叉单链上，序列与接头一样，只有与特异引物引导合成了接头的互补序列后，接头引物才能退火参与扩增。其缺点是成本较高，在应用YADE法时，为了得到合适的内切酶，需要从众多的内切酶中筛选，另外，特殊的接头往往也增加了实验的成本。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在转基因品系特异性检测过程中扩增基因组品系特异序列的方法。